Experimentální embryologie
Bi1130
Analýza lipidů a sacharidů
Mgr. Pavel Dobeš, Ph.D.
2022
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů2
Dnešní osnova
ANALÝZA LIPIDŮ A SACHARIDŮ
̶ charakteristika a příprava vzorků
̶ plynová chromatografie (GC)
̶ vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
̶ hmotnostní spektrometrie (MS)
̶ nukleární magnetická rezonance (NMR)
̶ vizualizace lipidů a sacharidů
̶ enzymové aktivity a inhibitory (analýza proteinů a genů)
̶ glykomika a lipidomika (metabolomika)
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů3
Co jsou lipidy a sacharidy?
Jaká je jejich funkce v embryogenezi?
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů4
Lipidy
̶ fosfolipidy, diacylglycerol (DAG), triacylglyceridy (TAG),
fosfatidylinositol fosfáty (PIPs), sfingolipidy, mastné
kyseliny, eikosanoidy, steroly (cholesterol, hormony)
̶ extra-, intracelulární, sérové > výběr vhodné metody a
přípravy vzorků (derivatizace)
̶ chromatografické metody (GC, HPLC), hmotnostní
spektrometrie, enzymatické aktivity a komponenty
metabolismu lipidů (biochemie, genová exprese fosfolipázy,
COX, LOX apod.), vizualizační techniky
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů5
Sacharidy
̶ monosacharidy (fruktóza, glukóza, galaktóza), disacharidy
(laktóza, maltóza, sacharóza), oligosacharidy a
polysacharidy (škroby, dextriny, glykogen)
̶ rozpustné ve vodě, málo teplotně stabilní, nemají
vlastnosti vhodné pro emisi fluorescence
̶ redukující sacharidy (sacharóza) mohou fungovat jako
redukční činidla
̶ chromatografické metody (GC, LC), spektrometrie
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů8
Chromatografie
̶ fyzikálně-chemické separační a analytické metody
̶ rozdělení analytu mezi stacionární a mobilní fází
̶ rozdílné analyty mají různou afinitu ke stacionární fázi,
jsou různě distribuovány mezi fázemi a zadržovány v
separační koloně po rozdílnou dobu
̶ kvalitativní i kvantitativní stanovení
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů9
Rozdělení chromatografických metod
̶ typ mobilní fáze (plynová, kapalinová)
̶ princip separace (adsorpční, iontově výměnná, gelová, rozdělovací,
afinitní)
̶ uspořádání (kolonová/sloupcová, kapilární, plošná/planární)
̶ účel (analytická, preparační)
Typ chromatografie Stacionární fáze Mobilní fáze Princip separace
Tenkovrstvá (TLC)
Papírová (PC)
pevná kapalina adsorpce
Plynová (GC)
kapalina (GLC)
pevná (GSC)
plyn
adsorpce, rozdělení,
bod varu
Vysokoúčinná kapalinová
(HPLC)
pevná kapalina
adsorpce,
absorpce/rozdělení,
molekulová hmotnost,
iontový náboj (ionex)
Superkritická fluidní
(SFC)
pevná
kapalina v
superkritickém stavu
(kapalný CO2)
adsorpce, rozdělení
10
Rozdělení chromatografických metod
̶ typ mobilní fáze (plynová, kapalinová)
̶ princip separace (adsorpční, iontově výměnná, gelová, rozdělovací,
afinitní)
̶ uspořádání (kolonová/sloupcová, kapilární, plošná/planární)
̶ účel (analytická, preparační)
DOI: 10.5772/56265
11
̶ mobilní fáze (eluent) nese analyty chromatografickým systémem
̶ analyty nesené mobilní fází interagují se stacionární fází (sorbentem)
Princip chromatografie
DOI: 10.5772/56265
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů12
̶ peaky, frakce
̶ retenční čas
̶ vnitřní nebo vnější standardy
Princip chromatografie
technologynetworks.com
kvantifikace
kvalitativní
analýza
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů13
̶ UV-VIS spektrofotometry
̶ fluorimetry
̶ refraktometry
̶ coulometry (elektrický náboj)
̶ ampérmetry (elektrický proud)
̶ konduktometry (vodivost)
̶ detektory s diodovým polem (Diode Array Detectors, DAD)
̶ teplotně vodivostní detektory
̶ plamenoionizační detektory (pro GC)
̶ detektory elektronového záchytu
̶ radiometry (pro TLC)
̶ hmotnostní spektrometry
̶ a další typy detektorů
Chromatografie - detektory
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů14
̶ Gas Chromatography (plynová chromatografie)
̶ separace organických látek a plynů
̶ těkavé molekuly se pohybují GC systémem rychle, méně volatilní
pomaleji
̶ robustní metoda
̶ analýza stovek až tisíců látek najednou (GC x GC) v různých vzorcích
̶ snadné propojení s dalšími metodami (MS)
̶ pouze pro volatilní a termostabilní látky
̶ obvykle pro látky do molekulové hmotnosti 1250 Da
̶ může docházet k úniku plynu ze systému
GC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů15
GC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů16
̶ mobilní fází je inertní plyn (helium, dusík, agon)
̶ průchod mobilní fáze přes molekulární síta > odstranění kyslíku, vody,
uhlovodíků
̶ průtok náplňové kolony 10-60 ml/min, kapilární kolony 1-2 ml/min
̶ vzorky (jednotky/desítky µl) míchány s rozpouštědly (heptan, aceton,
metanol) a vstřikovány injekčně do proudu mobilní fáze přes septum
̶ stacionární fáze na vnitřním povrchu kolony (sklo, nerezová ocel;
délka 1-150 m; vnitřní průměr 0,1-4 mm)
̶ kolona umístěna ve vyhřívané komoře kvůli regulaci teploty
̶ stacionární fáze pevná nebo kapalná (silikonové polymery a
polyestery jako kyanopropyl-/polydimethyl-siloxan, polyethylenglykol)
̶ vzorky se injikují těsně před kolonou přes septum, nástřik při teplotě o
20-50 °C vyšší než v koloně (rychlý přechod do plynné fáze)
̶ teplota v koloně 150-300 °C
GC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů17
̶ Flame Ionization Detectors (FIDs)
̶ zapotřebí přívod vodíku a kyslíku do oblasti detektoru za kolonou
̶ eluované analyty jsou spáleny v plameni (destrukce analytu!)
̶ vzniklé ionty zvyšují vodivost plamene
̶ anionty putují k anodě a kationty ke katodě, měřen vznikající proud
GC – detekce pomocí ionizace v plameni
doi.org/10.1016/B978-0-08-096949-7.00016-9
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů18
̶ kvantifikace mastných kyselin v jaterní tkáni potkana
̶ optimalizace přípravy vzorků (např. přečištění, hydrolýza esterových
vazeb, zvýšení těkavosti acylací, esterifikací apod.)
GC výstup
kontaminace volným cholesterolem
doi: 10.3791/51445
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů20
̶ High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová
chromatografie), High Pressure LC (200–250 bar), High-Priced LC
̶ kvalitativní analýza, kvantifikace i preparace jednotlivých analytů
̶ vysokotlaká pumpa zajišťuje pohyb mobilní fáze (0,5 – 2 ml/min)
̶ vzorky (desítky µl) se aplikují přes dávkovací smyčky
̶ stacionární fáze v koloně kryté kovovým pláštěm
HPLC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů21
HPLC
https://cs.wikipedia.org/wiki/HPLC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů22
̶ náplňové i kapilární
̶ ideálně s malým objemem a vnitřním průměrem (0,1 - 5 mm) > vyšší
účinnost, nižší limit detekce, stačí malé objemy mobilní fáze
̶ nanobore kolony (vnitřní průměry 25 - 100 µm), open-tubular kolony
(pod 25 µm), analytické HPLC čipy
̶ velikost částic náplně (1,8-10 µm) určuje účinnost kolony vs. potřeba
vysokých tlaků nebo krátké kolony
̶ stacionární fáze navázaná na silikagel a relativně polární (např. silanol-,
amino- nebo nitrilové skupiny), polymerní (uhlovodíkové zbytky nebo
ionexy navázané na grafitovém polymeru) a další specifické
̶ mobilní fází nepolární rozpouštědlo (obvykle hexan, pentan, chloroform)
̶ filtry pro odstranění nečistot (HPLC grade chemikálie), degassery
HPLC kolony
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů23
̶ reverse phase HPLC
̶ separace polárních látek
̶ polární mobilní fáze (směs vody a organického rozpouštědla jako je
acetonitril, tetrahydrofuran nebo metanol)
̶ nepolární stacionární fáze (silikagel s navázanými ligandy ve formě
uhlíkatých řetězců –C8, –C18 nebo jiných skupin jako –CN)
HPLC vs. RP-HPLC
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů24
̶ ultra-HPLC
̶ operuje za vyšších
tlaků
̶ vyšší rozlišení,
průchodnost
a účinnost
než klasická HPLC
̶ technicky
náročnější
̶ dražší
UHPLC
ssi.shimadzu.com
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů26
̶ Mass Spectrometry (MS)
̶ analytická metoda založená na převedení analytů na ionty a jejich
následnému rozlišení podle poměru hmotnosti a náboje (m/Q)
̶ zaznamenávají se relativní intenzity jednotlivých iontů
̶ vysoká citlivost
̶ kvalitativní i kvantitativní
̶ minimální objemy vzorku
̶ vysoké pořizovací a provozní náklady
̶ destruktivní metoda
Hmotnostní spektrometrie
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů27
̶ iontový zdroj (převod neutrálních molekul analytu do ionizovaného
stavu v plynné fázi)
̶ vakuový systém
̶ hmotnostní analyzátor (rozdělení iontů ve vakuu)
̶ detektor (detekce iontů a určení relativní intenzity)
̶ zařízení pro záznam a zpracování dat
Hmotnostní spektrometr
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů28
̶ nutné volit podle charakteristiky analytu
̶ fungují za atmosférického tlaku nebo ve vakuu
̶ udělují analytu různé množství vnitřní energie (tvrdé vs. měkké)
̶ ESI (nejšetrnější) < MALDI < APCI < CI < EI (nejtvrdší)
̶ Elektronová ionizace (EI)
̶ Chemická ionizace (CI)
̶ Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
̶ Elektrosprejová ionizace (ESI)
̶ Laserová desorpce a ionizace za účasti matrice (MALDI)
̶ Fotoionizace
̶ Indukčně vázané plazma (ICP)
̶ a další
Hmotnostní spektrometr – iontové zdroje
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů29
̶ tvrdá technika, ionizace v proudu elektronů (70 eV)
̶ fragmentace molekulárních iontů > vznik iontů s lichým počtem
elektronů (M+.)
̶ těkavé a termostabilní látky; hmotnostní rozsah do 1000 Da
̶ probíhá ve vakuu (10−3 až 10−4 Pa)
̶ rozsáhlé knihovny EI spekter
Elektronová ionizace (EI)
Evan Mason CC BY-SA 4.0,
M + e- > M+. + 2e-
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů30
̶ měkká technika
̶ v principu EI se zdrojem reakčního plynu (metan, amoniak, vodní
pára) o tlaku 50-100 Pa, který je ve výrazném nadbytku oproti vzorku
̶ nejdříve se ionizují molekuly reakčního plynu, které následně ionizují
analyty
̶ vznik [M+H]+ nebo [M-H]- (de-/protonace) a jiných aduktových iontů se
sudým počtem elektronů
̶ pouze těkavé látky; hmotnostní rozsah do 1000 Da
̶ modifikací chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
Chemická ionizace (CI)
creative-proteomics.com/support/chemical-ionization.htm
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů31
̶ měkká technika > [M+H]+ nebo [M-H]-, aduktové ionty, fragmentové
ionty minimálně (více informací o struktuře analytů ESI-MS/MS)
̶ rozpuštěný analyt se přivádí kovovou kapilárou > pod vysokým
napětím rozprášení do nabitých kapiček (zmlžovací plyn) >
odpařování rozpouštědla a zvýšení povrchového napětí > rozpad na
menší kapičky s dílčím nábojem (Coulombická exploze)
̶ látky středně polární až iontové; nejčastěji kombinace HPLC/MS
̶ hmotnostní rozsah v řádu stovek kDa
̶ vhodná pro biomakromolekuly včetně např. sacharidů
Elektrosprejová ionizace (ESI)
DOI: 10.1155/2012/282574
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů32
̶ měkká technika > [M+H]+, [M+2H] 2+, [M-H]-, aduktové ionty
̶ pro látky s vysokou molekulovou hmotností (stovky kDa, biopolymery)
̶ nepolární i polární analyty
̶ vakuum, snížený i atmosférický tlak
̶ vzorek a matrice (např. aromatické karboxylové kyseliny) naneseny
na MALDI terčík > desorpce laserovým pulzem (dusíkový UV, IČ) >
excitované molekuly matrice stabilizovány za vzniku iontů analytu
Laserová desorpce a ionizace za účasti
matrice (MALDI)
CC-BY-SA-3.0
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů33
̶ kombinace ESI a desorpční ionizační techniky
̶ vzorek je umístěn před sprejovací kapilárou a vstupem analytu k
detektoru
̶ lze použít přímo živočišnou tkáň bez úprav
Desorpční ionizace elektrosprejem (DESI)
DOI: 10.1039/C0AN00688B
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů34
̶ dělení iontů v plynné fázi za vakua podle poměru jejich hmotnosti
a náboje
̶ typicky v prostředí vysokého vakua (10-3-10-11 Pa) kvůli možným
kolizím iontů s neutrálními atomy
̶ magnetické a elektrostatické (zakřivení dráhy letu)
̶ kvadrupól a iontové pasti (oscilace)
̶ TOF (doba rychlosti letu)
̶ orbitrap (frekvence harmonických oscilací)
̶ a další
Hmotnostní spektrometr – analyzátory
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů35
̶ využívají elektrického a/nebo magnetického pole k ovlivnění dráhy
a/nebo rychlosti pohybu iontů
̶ větší zakřivení pro ionty s nižší hodnotou m/Q
̶ výběr iontů podle hmotnosti/náboje, magnetické nebo potenciálové
skenování, sledování v reálném čase
Sektorové analyzátory
shimadzu.com
36
̶ urychlení iontů napěťovým pulzem a směrovány do analyzátorové
trubice
̶ pulzní ionizace často MALDI (MALDI-TOF)
̶ měří se doba letu než urychlený iont dorazí na detektor
̶ ionty o stejném náboji mají stejnou kinetickou energii a rychlost
závislou na své hmotnosti
̶ lehčí ionty detekovány nejdříve
̶ rychlá analýza (časy řádově ns až µs), neomezený rozsah pro detekci
poměru hmotnosti a náboje
Analyzátory doby letu (Time of Flight, TOF)
https://portal.matematickabiologie.cz
37
̶ nízká cena, jednoduchost
̶ často používán v kombinaci s GC, LC a v hybridních MS
̶ elektrické pole vytvořené ze čtyř paralelních elektrod
̶ oscilace elektrického pole de-/stabilizuje dráhu procházejících iontů
̶ selektivní hmotnostní filtr (v aktuálním nastavení jsou oscilace stabilní
vždy pouze pro ionty s určitou hodnotou hmotnost/náboj; změna
potenciálu elektrod zajišťuje rozsah zachycovaných m/Q = skenování)
Kvadrupólový analyzátor
DOI: 10.17760/d10016740
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů38
̶ trojitý kvadrupól (QqQ):
Q1 – hmotnostní filtr
q2 – kolizní cela s plynem (excitace iontů a vznik fragmentů)
Q3 – analýza fragmentů
̶ sekvenční analýza, levné a vysoce účinné uspořádání
Kvadrupólový analyzátor
Klin Onkol 2012; 25(Suppl 2): 2S70– 2S77
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů39
̶ elektrostatická orbitální past vřetenovitého tvaru
̶ ionty se pohybují mezi středovou a vnější elektrodou
̶ na vnějších elektrodách se měří proud indukovaný ionty
̶ převedení dat na hmotnostní spektrum Fourierovou transformací
Orbitrap
creative-proteomics.com
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů40
̶ detekce iontů přicházejících z analyzátoru (Orbitrap je i detektorem)
̶ pracuje ve vakuu
̶ dříve využití fotografických desek
̶ elektronové násobiče (dopad iontu na dynodu a uvolnění elektronu)
̶ fotonásobiče (ionty dopadají na konverzní dynodu a uvolněné
elektrony na fosforovou destičku uvolňující fotony)
̶ Faradayova klec (dopad iontů na dynodu a uvolnění elektronů >
indukce proudu, který je měřen)
Hmotnostní spektrometr – detektory
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů42
̶ použití MS jako chromatografického detektoru
̶ ionizace neutrálních analytů pocházejících z chromatografické kolony
̶ problémem mohou být rozdíly tlaků mezi GC/HPLC a MS (vakuum)
̶ odstranění nosného plynu (GC) a kapaliny (HPLC)
̶ mobilní fáze se může účastnit ionizace
̶ určení poměru hmotnost/náboj
̶ 3D data, kvalitativní i kvantitativní analýza
Kombinace GC-MS, HPLC-MS
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů44
̶ vysoká rozlišovací schopnost a citlivost
̶ využití statického magnetického pole (o síle do 7 T; neionizující
záření), a tedy možnost neinvazivního použití in vivo
̶ nutno brát ohled na ohřívání vzorku radiofrekvenčním zářením
(Specific Absorption Rate = SAR)
Nukleární magnetická rezonance (NMR)
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů46
̶ doi: 10.1016/j.jmr.2021.107142
̶ studium možnosti využití NMR na mikroskopických vzorcích (savčí embrya,
organoidy apod.) > sledování kvality embryí při IVF
̶ využití mikročipu v kombinaci s 3D mikrotiskem
̶ bovinní embrya v tekutém dusíku (dvoubuněčné až morula) > rozmraženo >
měřeno po dobu 50 min na embryo
NMR v embryologii
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů47
NMR v embryologii
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů49
̶ především pro sledování distribuce v tkáních a buňkách (kvantitativní:
biochemické stanovení celkových TAG a volného cholesterolu)
̶ simultánní analýza vzorků umožňuje relativní kvantifikaci (vliv teploty,
koncentrace barvy, inkubačních časů, nastavení mikroskopu atd.)
Lipidy
̶ rozpustné v organických rozpouštědlech (rozpouští tkáně celkově!)
̶ velká část lipidů mizí při přípravě parafinových řezů, použití kryořezů
̶ kolorimetrická stanovení
̶ membránové lipidy
Sacharidy
̶ enzymatická stanovení, lectin-based staining
̶ Alcian blue stain (barvení mucinů); kyselina jodistá - Schiff (PAS =
Periodic Acid Shiff, barvení polysacharidů, glykogenu) a další
Vizualizace lipidů a sacharidů
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů50
̶ vizualizace neutrálních lipidů ve fixovaných tkáních a buňkách
̶ fixace ve 4% paraformaldehydu
Oil Red O (ORO staining)
ORO barvení vaskulatury
ISV, intersegmental vessels
DA, dorsal aorta
DOI: 10.1387/ijdb.072519jx
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů51
̶ vizualizace neutrálních lipidů ve fixovaných tkáních a buňkách
̶ fixace ve 4% paraformaldehydu
̶ barvení méně výrazné proti ORO > vysoké koncentrace lipidů (fat body)
Sudan Black
Zebrafish embryo
DOI: 10.1182/blood-2007-06-095398
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů52
̶ vizualizace neutrálních lipidů v nezafixovaných tkáních a buňkách
̶ kvalitativní stanovení velikosti a tvaru tukových kapének, nedoporučeno
pro kvantifikaci tukových zásob
̶ obarvení a vysušení preparátu s NR a 75% glycerolem
̶ konfokální mikroskopie
Nile Red
Akumulace neutrálních
lipidů během oogeneze u
Drosophila melanogaster.
DOI: 10.1016/S0925-4773(03)00158-8
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů53
̶ značení živých (průtoková cytometrie) i fixovaných buněk a tkání
̶ barvení vnitrobuněčných lipidů, tukových kapének a buněčných
membrán
Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans
reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches
doi: 10.1194/jlr.D011940
BODIPY fluorescenční značení
Bi1130 - Analýza lipidů a sacharidů55
Děkujeme Vám za pozornost