Imunologie cvičení 6
 Metody sledování antioxidantů
•
•
  MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Oxidační stres
•Reaktívní kyslíkové a dusíkové radikály fyziologicky slouží k destrukci patogenů a regulačním
procesům např. ve stěnách cév aj.
•
•Při jejich nadprodukci (která může být prospěšná pro likvidaci patogena) může však docházet k
oxidativnímu poškození vlastních buněk a tkání.
•
•Radikály napadají biomolekuly: lipidy, nukleové kyseliny a proteiny a způsobují změny jejich
struktury, což se odráží na změně funkce těchto molekul.
•
•V případě lipidů hovoříme o lipidové peroxidaci a lipidy jsou častým a důležitým cílem
oxidativního poškození.
•
•V organismu existují přirozené antioxidační mechanismy, které eliminují riziko oxidačního
poškození

Antioxidanty
Konkurují jiným potenciálně oxidovatelným substrátům a tím je chrání přes poškozením radikály
Enzymatické:
superoxid dismutáza  SOD - přeměňuje superoxidový radikál na peroxid vodíku
kataláza CAT - rozkládá peroxid vodíku
glutathion peroxidáza GPX – rozkládá peroxid vodíku na vodu za současné oxidace glutathionu

Glutathion: tripeptid glutamylcysteinylglycin. Při oxidaci glutathionu může vzniknout disulfidový
můstek mezi dvěma jeho molekulami (vzniklý dimer glutathionu se výstižně označuje GSSG). GSSG je
možné redukovat zpět na dvě molekuly GSH:
1)vznik oxidované formy glutathionu (zkr. GSSG)
 GSH + H2O2 ----- GSSG + 2 H2O
2) regenerace oxidované formy glutathionu na redukovanou
 GSSG + NADPH + H+ --------- 2 GSH + NADPH

Antioxidanty
Neenzymatické:
Vitamíny - A, E, C
kofaktory enzymů -  koenzym Q10
dusíkaté sloučeniny – kyselina močová
Přírodní barviva – karotenoidy, flavonoidy aj
Chrání nás před oxidačním stresem. Kde hledat antioxidanty? | Vím, co jím

Stanovení celkové antioxidační kapacity
Stanovuje se v různých biologických vzorcích:
plasma, sérum, hemolymfa, potraviny (mléko, ovocné a zeleninové štávy apod.)
spektrofotometrická
spektrofotometrická
fluorescenční
luminometrická
Princip:
ABAP produkuje peroxylový radikál a ten oxiduje fluorescein, který je tímto degradován a přestává
svítit.
Pokud jsou ve vzorku antioxidanty, tak vychytají peroxylový radikál,  tím je ochráněn fluorescein a
může svítit
Jako standard se používá Trolox – jedna molekula Troloxu vychytá dvě molekuly peroxylového radikálu

Složky reakční směsi a výstup měření
Do jamek pipetujeme:
Trolox/vzorek/PBS (blank)
Fluorescein
ABAP
Co do výsledků:
1.Kinetický graf závislosti fluorescence na čase pro jednotlivé koncentrace Troloxu (standard)
2.Kinetické grafy pro jednotlivé vzorky
3.Graf závislosti integrálu fluorescence na koncentraci Troloxu a určit rovnici kalibrační přímky
4.Z rovnice kalibrační přímky určit koncentraci antioxidantů ve vzorcích a vyjádřit ji jako
mikromoly Troloxu