Metody separace buněk



Metody separace buněk
Používají se tzv. selekční protilátky, které jsou pevně navázány na magnetické částice.
Používá se v pozitivním nebo negativním uspořádání
Pozitivní separace spočívá ve výběru buněk podle přítomnosti určitého znaku (povrchové molekuly)
Negativní spočívá v odstranění všech, které specifický znak nenesou.
pozitivní
negativní

Gradientová separace
ery plus granulocyty
histopaque
Hledaná vrstva mono
plus lymfocyty
Plasma plus tromb.
Metoda založená na rozdílné hustotě buněk.
Navrstvení heparinizované krve na separační gradient (např. dextran, Ficoll, Histopaque). Po
následné centrifugaci dojde k typickému rozdělení buněk

E-rozetový test
E-rozetový test – test k průkazu počtu T mfocytů. Spočívá v schopnosti interakce CD2 molekuly na
povrchu T buněk s beraními erytrocyty majícími na povrchu molekulu odpovídající LFA-3, tj. CD58.
E-rozeta je mikroskopicky pozorovatelný beraní erytrocyt obklopený T buňkami
Ery – bílá šipka, rozetují kolem centrální buňky – černá šipka
Lefnerová DP MU
Detily rozet ery
Podobně B-lymfocyt reaguje s myšími erytrocyty.
X166 kultura borelií obklopená ery

Velikost útvarů v počítací sítu
Pravidlo pro počítání částic v počítací komůrce. Do celkového počtu částic se započítávají  pouze
ty,  které  leží  nebo  se  dotýkají dvou zvolených  stran,  v tomto případě horní a levá (označeny
černě). Částice dotýkající se pravé a spodní strany
nezapočítáváme (označeny šedě).
Počítací síť  Bürkerovy komůrky
Počet před separací v plné krvi – leukocyty
Zjištěná hodnota se musí ještě přepočítat pro lymfocyty

Úkol: Z vypočítaných hodnot určujících počet agranulocytů před a po separaci, určete výtěžnost
vlastní
separace v %.
1. Spočítat množství leukocytů v původním vzorku krve:  počet buněk/mikrolitr krve
    a vypočítat z toho počet lymfocytů (na základě diferenciálu nebo podle fyziologických hodnot)
2. Spočítat množství  počet buněk - lymfocytů po separaci: počet lymfocytů/mikrolitr
3. Přepočítat na použité objemy (mn. plné krve na počátku separace a mn. sesbírané vrstvy po
separaci)
4. Trojčlenkou určit výtěžnost reakce:
             celkový počet buněk vstupujících do reakce ………………100 %
             celkový počet buněk po separaci……………………………………X %

Uveďte počet leukocytů v původní krvi před separací. Z těchto hodnot vypočtěte, kolik agranulocytů
vstupovalo do separace v původních 600 μl krve
Vycházejte z koncentrace buněk zjištěné v kroku 4 postupu, objemu krve použité pro separaci a toho,
že podle fyziologických hodnot tvoří lymfocyty a monocyty 80 % všech leukocytů myši.