Jak vytvořit geneticky modifikovanou rostlinu?
Markéta Šámalová
\čtf> Oddělení
\| experimentální
%0 biologie rostlin
► GENOMIKA
DNA replication
DNA repair letic recombinatron
5'
3'
DNA
► TRANSCRIPTOAAIKA
RMA synthesis (transcription)
RNA
5"
i*3
► PROTEOMIKA
protein synthesis (translation)
PROTEJN
H2N
► Další „OMICs"
COOH
amino acids
Kroky při tvorbě transgenní/GMO/upravené rostliny
1. Výběr genu (např. z databáze)
2. Navržení klonovací strategie a primerů (= oligos)
3. PCR a klonování genu do plazmidu (= vektoru)
► 4. Transformace E. coli a replikace plasmidu
5. Izolace plazmidu
6. Sekvenování genu (DNA)
7. (Re-klonování do binárního vektoru pro trasformaci rostlin)
8. Transformace Agrobacteria
► 9. Transformace rostlin
► Arabidopsis - "f loral dip"
► Tabák, rýže - techniky tkáňových kultur
► (Transientí exprese)
10. Selekce transf ormantů
fLAKT t€Li
Klonování
► V molekulární biologii se termín klonování DNA používá ve významu vytvoření mnoha identických kopií (obvykle miliard) molekul DNA -amplif ikace určité sekvence DNA.
► Geny lze klonovat pomocí bakterií nebo PCR (polymerázová řetězová reakce)]
► Klonovat lze jakoukoli DNA (fragment)
► Klonovat lze jakéhokoliv jedince
ATG
STOP
PRIMER F.
Ľ
GENE
— PRIMER R
Promoter
Promoter
m
GENE
m
Terminator (pA)
noSTOP!
Promoter
m
GENE
xFP
LB
Left Border
| Pro
Promoter
I
GENE
xFP
* unique cloning site
Plasmid = kruhovitě uzavřená molekula DNA, schopná replikace
PCR ~ Polymerase Chain Reaction
► Pár PRIMERS (neboli OUGOs) řídí syntézu požadovaného segmentu DN
51 31
3' 5'
STEP 1
HEAT TO SEPARATE STRANDS
STEP 2
COOL TO ANNEAL PRIMERS
STEP 3 DNA SYNTHESIS
I
region of double-stranded DNA to be amplified
JUL
T
+ DNA polymerase + dATP + dGTP + dCTP + dTTP
1
P
S'
31
5'
a  pair of primers
FIRST CYCLE OF AMPLIFICATION
dNTPs
products of first cycle
Každý cyklus PCR zahrnuje 3 kroky:
► separaci vláken (denaturation)
hybridizaci (annealing)
► syntézu DNA (extension)
PCR používá k amplif ikaci DNA opakovaní cyklů.
Speciální DNA polymeráza (z termofilní bakterie, Taa) stabilní při mnohem vyššícn teplotách než eukaryotická DNA polymeráza.
END OF FIRST CYCLE
SECOND CYCLE (produces four double-stranded DNA molecules)
THIRD CYCLE (produces eight double-stranded DNA molecules)
Klasické klonování využíva reštrikční nukleá;
► Reštrikční nukleázy Štěpí DNA ve specifických nukleotidových sekvencích
► Pocházejí z bakterií, napr. EcoRI pochází z Eschericiha coli (E. coli)
► Až 1000 komerčně dostupných!
Blunt-ended ĎNA
► "sticky ends" -short, single -stranded overhangs
5' 3'
5' 3'
cleavage sate
G G	C C
	
5' 3'
C T T A A
1		
A	A G C T T	
T T C G A		
		A
		
Haelll
5' 3r
G G C C
EcoRI
Hindlll
5' 3'
S' 3'
C T T A A	G
	
A	A G C T T
	+
T T C G A	
► Novější např. GATEWAY klonování ~ není potřeba restrikČních endonukleázi
► Používá rekombinaČní sekvence, "Gateway att" místa a směs klonázy (Clonase mlx\
► Golden Gate, Green Gate (f or plants), GeneArt jsou další klonovací systémy
Gelová elektroforéza rozděluje molekuly DNA podle jejich velikosti
► ĎNA běží od- k +
Base Pairs Mass (ng)
1.517 45
►   ĎNA žebříček (ĎNA ladder) ►   ĎNA velikost a hmotnost
DNA double-stranded size DNA markers
negative electrode
e
23 -
s
,* 6.5
E
I ta
72 4.3
1
■z
2.3
2
positive 0 electrode
CUT WITH EcoRI
CUT WITH Hindlll
LOAD DNA ONTO GEL AMD APPLY VOLTAGE
T7T71
top
direction of
migration
j_
bottom
Ligace DNA a replikace fragmentu
ĎNA
fragment je
vložen do
bakteriálního
plazmidu
pomocí
enzymu ĎNA
ligázy.
ĎNA
fragment
může být
replikován
(klonován)
uvnitř
bakteriální
buňky.
circular, double-stranded
Plasmid DNA (cloning vector)
DNA fragment to be cloned
recombinant DNA
CLEAVAGE WITH RESTRICTION NUCLEASE
COVALENT LINKAGE BY DNA LIGASE
DOUBLE-STRANDED RECOMBINANT PLASMID DNA INTRODUCED INTO BACTERIAL CELL
bacterial
cell
cell culture produces hundreds of millions of new bacteria
many copies of purified plasmid isolated from lysed bacteria
Izolace DNA
► Izolace plasmidu: 3 kroky - lyzace, neutralizace, DNA purif ikace
► Často se používají komerčně dostupné KITy
Bakteriální Lyzace a Navázání DNA na Eluce kultura      neutralizace  kolonku a promývání
► Izolace genomové ĎNA (gĎNA)
► Izolace genomové ĎNA z rostlin, hub i živočichů.
DNA (Sanger) sekvenování
Ďideoxy sekvenování (vyvinuté Ďr. Sangerem):
používá přiměř, DNA polymerázu a speciální dideoxyribonukleosidtrifosfáty (ddNTP)
►  když jsou inkorporovány do rostoucího řetězce DNA, ddNTP blokují jeho další prodlužování a také každý obsahuje různý fluorescenční marker,
vytvoří se částečné kopie fragmentu DNA, který má být sekvenován,
seřazení podle velikosti fragmentů DNA,
automatizované vyhodnocení sekvence.
i C ATA GCATAT
G CATAT GCATATGT
GCATATGTC
PRODUCTS
LOADED ONTO
CAPILLARY GEL -
electrophoresis
- ADD LAEELiO EMAr^MEP.
B" SCAT J
3" OJTATACA-GT-CAGGTT- 5'
ADD DhA PŮ.tWEÍAÍF ANODMDE INTO 4 SEPARATE TUBES
c1Gcf ADO EXCESS A MO U NTS J A ľE^C T  OF HQRMAL a1.-?!
ADD iiAM.il. AMOUNT CF O'iE CHŕlfl-ľlHHINAIHD ťHHT? IQ EACH TUBE
H      H r
d CAT ■ r^l GrCAT ATGTCA 1-ľ--"
scat      .:r gcat    - l
ecat 4tqtcaľítc attjtcj.g scat mutlauttc ■Hatltcagtd:
h rT
I
c c
T D 4
Ĺ T G T
size-separated products are read in sequence
T T C TATA
TCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCAT G G T
REEWT
mi-at LrNAplnw
Second generation sequencing - e.g. Illumina
Transformace rostlinných buněk Agrobacteri
V přírodě se vyskytující Ti plazmid z Agrobacerium tumefaciens
Ti plazmid dokáže vložit DNA do rostlinného genomu
Přenese se pouze malá Část plazmidu'. T-ĎNA
Binární plazmid
obsahuje T-DNA a vir geny (virulence)
Někdy vir geny mohou být na odděleném "fie/per" plazmidu
o
II
C—CH3
CH30
OCH,
Agrobacterium
OH
Acetosyringone
Acetosyringon se pouziva jako chemický atraktant např. při transientní expresi
Wounding
Cytokinin
Auxin
Opines
Transport
Plant cell
Transformace rostlinných buněk Agrobacteri
V přírodě se vyskytující Ti plazmid z Agrobacerium tumefaciens
Ti plazmid dokáže vložit DNA do rostlinného genomu
Přenese se pouze malá Část plazmidu'. T-ĎNA
Binární plazmid
obsahuje T-DNA a vir geny (virulence)
Někdy vir geny mohou být na odděleném "fie/per" plazmidu
vir genes
Bacterial genomic DNA
Bacterial cell
Ti plasm
T-DNA
Wild-type T-DNA Left border (LB)
Genes for production of hormones and opines (oncogenes)
Right border (RB)
-V
Engineered T-DNA
I
Gene of interest
-V
Antibiotic resistance gene
Transgenní rostliny vyrobené pomocí tkáňových kultur
,Snadna% transformace rostlinných buněk
"floral dip" metoda
používaná se pro Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní)
Použiti "gene gun
Helium gas
Disk with DNA-coated gold particles
Restraining membrane
Disk stopped by screen
Microprojectiles (DNA-coated gold projectiles)
Target plant tissue
Agrobacterium není zapotřebí! Ale the gun je zapotřebí!!!
Transientní genová exprese
Metoda"agroinfiltrace", velmi efektivní způsob, jak studovat geny
► Na principu dočasné vysoké transkripce DNA sekvencí, které se nemusí nutně integrovat do rostlinného genomu!
1
► Přechodná exprese, trvá pouze 48-72 hodin
► Např. lokalizace fluorescenčního proteinu, interakce protein/protein
v
3. TRANSIENT GENE EXPRESSION ASSAY
tabák
Nicotiana benthamiana
Proč vyrobit geneticky upravenou rostlinu?
Proč vyrobit geneticky upravenou rostlinu?
► Pro studium exprese a funkce genu
► Kdy a kde je gen exprimován?
► Role promotoru a reportérových genů
► Co se stane, když zvýšíme expresi genu?
► Chemicky regulovatelné transkripční aktivační systémy
► Co se stane, když snížíme expresi genu nebo jej vyřadíme z funkce?
► amiRNA, CRISPR/Cas9
► Pro zlepšení vlastností rostlin
► Klasické šlechtění a domestikace divoké trávy teosinte (vlevo) vedly po stovky let k plodině Zea mays (kukuřice, vpravo).
Zlatá rýže" byla vyrobena vložením 2 cizích genu zapojených do syntézy p-karotenu
(A) Geranylgeranyl-PP
^  Phytoene synthase
Phytoene + 2 pyrophosphate ^ a? 7
^-carotene ^ crt1
(B)
Golden Rice
Lycopene
i
Lycopene cyclase
ct-carotene ß-carotene
► Golden Ricc je nutričním zdrojem pro-vitaminu A, který zlepšuje imunitní odpověď Člověka na běžná onemocnění a významně snižuje dětskou slepotu, jejíž hlavní příčinou je nedostatek vitamínu A.
► Byla získána již před > 20 lety, ale stále je zakázána.....