uchovaní genetických zdroju
12.
definice, metody, použití
EVROPSKÁ UNIE
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OPVidHáváni MLÁDEŽE A TELOVÝCHOVY     pn> konkurenceschopnost
1
INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Uchovaní genetických zdroju
ztráta genetických zdroju je nenahraditelná uchováváme:
• původní rostlinné druhy - výskyt v přirozených ekosystémech - jejich ohrožení je určeno podle míry ohrožení těchto ekosystému
vyšlechtěné kultivary - udržovací šlechtění je pracné a nákladné
Uchovaní genetických zdroju
uchování semen = nejběžnější a nejstarší metoda
uchování vegetativních orgánů - hlízy, kořeny,
cibule, řízky (rizika akumulace viru a jiných patogenu)
Uchovaní genetických zdroju:
A. semena
uchování semen klasicky = pri normální teplotě (max. 1 - 5 let)
semenné banky = uchovaní semen na delší dobu ( při - 20°C)
ortodoxní semena - přežívají snížení obsahu vody na 5-10%
rekalcitrantní semena - dehydratace nesmí klesnout pod limit 12 -30% ■ ^> nelze skladovat pod 0°C, tropické druhy pod 10 C
(kávovník, kakaovník, kokosová palma, kaučukovník, z našich: dub, buk, jírovec, kaštanovník)
https://www.kew.org/science/collections-and-resources/collections/seed-collection
Uchovaní genetických zdroju: B.   vegetativní orgány
uchovávání vegetativních orgánu
(hlízy, kořeny, cibule, řízky)
rizika:
• choroby (houbové, virózy)
• škůdci
• nepříznivé podmínky (teplota, vlhkost...)
• pracné a nákladné (prostory, manipulace)
Genové banky in vitro
uchování aktivně rostoucích kultur uchování kultur v minimálním růstu kryoprezervace
Uchovaní aktivně rostoucích kultur
- pracné - pasáže: dny, týdny, měsíc
- nákladné (energie, prostory)
- nebezpečí infekce
- nebezpečí somaklonální variability představují paralelu ke klasické polní bance
hledaly se podmínky pro prodloužení subkultivačního intervalu
Uchovaní kultur v minimálním růstu
• metody založené na kultivaci při snížené teplotě rostliny z mírného pásma:       20 - 25°C 4 - 10°C
rostliny z tropu:
25 - 30°C
15 - 20°C
• metody založené na modifikaci složení kultivačního média - snížení koncentrace solí (MS1/2 - MS1/4), přídavek osmotika - 37© manitol, 57© sacharóza, ABA
• metody založené na modifikaci plynného složení atmosféry v kultivačních nádobách
Uchovaní kultur v minimálním růstu
Výhody:
možnost vizuální kontroly
testování na patogeny - možnost mezinárodní výměny
menší nároky na prostor (2m2 x 1 ha)
Problémy:
stres muže mít vliv na regenerační schopnost
muže být ovlivněna genetická stabilita - nutnost kontrol
(kritéria morfologická, cytologická, biochemická, molekulárně-biologická = DNA)
Solanum, Medicago, Fragaria, Prunus, Malus, Beta
Definice kryoprezervace
uchování materiálu při nízkých teplotách, nejčastěji v tekutém dusíku (-196°C) (P. Ďebergh)
• neletální skladování pletiv nebo tkání při ultra-nízkých teplotách (E. E. Benson)
uchovaní rostlinného materiálu po delší dobu za účelem
■ minimalizace rustu a vývoje in vifro
■ uchovaní životaschopnosti a genetické stability
■ zachovaní plného vývojového a funkčního potenciálu
■ šetření pracnosti a nákladu
Mechanismy kryo-poškození
tvorba ledu
■ extracelulární - začíná dříve
■ intracelulární (nukleace) - velké ledové krystaly poškozují struktury organel = snaha o zmenšení velikosti krystalu ledu
vlivy poškození různými roztoky
Přístupy ke kryoprezervaci
tradiční = aplikace chemických kryoprotektiv a kontrolované, pomalé zmrazování
0,5 - 1°C/ min
(vyžaduje speciální přístroje)
novější = rychlé zmrazování vitrifikace
enkapsu I ace/de hydr atace
(relativně dostupnější)
Možnosti kryoprotekce rostlinného materiálu
• penetrující - ovlivňují biochemické a strukturální
vlastnosti membrán a tak zvyšují toleranci k mrazu (ĎMSO, glycerol, prolin)
• nepenetrující - mají vliv většinou jako osmoticky dehydratační (sacharóza, manitol, sorbitol)
Krátkodobé skladovaní dospělých řízku révy
Vit i s vin i fera
• odebírání řízků v zimě
• skladovaní při -3°C = řízky rašily až po 1,5 roce
• hodnocení tolerance kryoexpozice meristémů vybraných linií z axenických kultur
• vývoj metod pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů révy
http://www.ars-grin.gov/ncgrp/pi_research_extra_projects.htm#grapepres
Pomalé kontrolované zmrazovaní
aplikace chemických kryoprotektiv
postupné kontrolované ochlazování pod bod mrazu (-30 až -60°C), pak vložení do tekutého dusíku
- pomalé ochlazování zvyšuje dehydrataci buněk, což snižuje bod mrznutí
- po zkoncentrování buněčných roztoku pomalým ochlazováním muže být zbývající voda
vitrif ikována rychlým zmrazením
zpětné rozmrazování má být co nejrychlejší
Prístroj Kryo 10
Průběh zmrazování vzorků kalusu
rrc/
-20-
netěsnosti ventilu
při napouštění N2
t/miň7
?2
3E
IF
60
teplota uvnitř ampule
teplota uvnitř chlazeného prostoru
70
ampule do N2
proces velmi rychlého zmrazení, při kterém je zabráněno tvorbě ledových krystalu, protože vodný roztok je příliš koncentrovaný - zabránění nukleace ledových krystalu
voda tuhne do tzv. sklovitého amorfního tvaru
negativně muže působit na životaschopnost
materiálu vysoká koncentrace kryoprotektiv, která je nutná pro navození vitrif ikace
•   vitrif ikace = nestabilní stav - muže vést k tvorbě krystalů při zahřívání
Postup: „Enkapsulace / dehydratace"
otužení materiálu - zvýšená osmotická hodnota média, snížená
teplota kultivace
izolace meristému enkapsulace: přenos do 3% alginátu nasátí alginátu s meristémem do špičky pipety nakapání alginátu do 0,1 M roztoku CaC\2 polymerace alginátu 30 min.
dehydratace: osmotická (0,75M sacharóza) 1-5 dní osušení ve sterilním vzduchu f low-boxu 1-4 hoc^ přenos vysušených kuliček do kryozkumavky rychlé zmražení - vhození do N2
Alginátové perly s vyrostajícími prýty brambor -I        (Solanum tuberosum) z enkapsulovaných n meristémů
Příklady využiti kryoprezervace
meristému
Německá sbírka mikroorganismu a buněčných kultur (ĎSMZ, Braunschweig, Německo) - meristémy 519 starých kultivaru brambor - metoda mrazení perel
International Potato Centre (CIP, Lima, Peru) - 345 kultivaru brambor - vitrifikace
K.U. Leuven, Belgie - 306 kultivaru banánu (1/4 ze světového počtu kultivaru) - vitrif ikace
kasava, česnek, máta a australské ohrožené druhy
Používaní metody kryoprezervace v Kew
Pteris
adscension
Paralophia epiphytica
http://www.kew.org/ksheets/pdfs/K31_cryopreservation.pdf
In vitro plants of Morus acidosa "Amami07"
Excision of shoot tips 1,5-2,0 mm L x 0.5-1,0 mm W Preculture
MS+ 0,2mg/l BA, Q.3MSUC, / Id / 25 °C Adhesion to cryo- plate with Na alginate sol.
Hardeningof the gel V byCaCb sol.
Immersion into LN and storage
Osmoprotectten: 2 M Glycerol + 0.6 M Sue. [0,6 M LS Sol.] /25 ' C/30 min Dehydration:
PVS2/25 "C/SOmin
i
Setting cry-plate into cryotu be
https ://www. n aro. af f rc. g o. j p/arch i ve/n i as/ eng/research/h23/nias02304.htm