Jméno: Datum: Téma 03: Příprava živného média Živné médium vhodného složení je jednou ze základních podmínek úspěšné in vitro kultury. Může se používat ve formě tekuté nebo ztužené různými gelujícími přípravky jako je agar, Gelrit® nebo karagenan. Média pro kultivaci explantátů obsahují živiny - makroelementy a mikroelementy ve formě anorganických solí, organické látky jako cukry, vitamíny a aminokyseliny, eventuálně růstové regulátory a ztužovací látky. Důležité je také optimální pH, které bývá v rozsahu 5,5 – 5,8. Média je možné připravovat smícháním jednotlivých složek (pro usnadnění práce se používají koncentráty) nebo navážením z hotové směsi. Pokud používáme ke kultivaci Petriho misky, rozléváme rozvařené a vysterilizované médium sterilně v laminárním boxu. V případě větších kultivačních nádob je možné rozlít rozvařené médium a následně je teprve vysterilizovat v autoklávu. Termolabilní látky vysterilizované filtrací přidáváme do mírně vychladlého média až po autoklávování a musíme pak médium rozlévat do sterilních nádob v laminárním boxu. Nejčastěji používaným médiem je univerzální médium podle autorů Murashige a Skoog (1962), které se používá v mnoha různých modifikacích. Další varianty živných médií se pro speciální účely nebo rostliny také používají (např. Gamborg et al. 1968, Nitsch et Nitsch 1969, Lloyd et McCown 1980, Chu et al. 1975). Materiál: (vypsat podle vlastní připravované varianty) Pomůcky: (vypsat) Postup práce: A. Příprava 1 litru agarem ztuženého média s použitím koncentrátů (neděláme) 1. Navážíme 5,5 g agaru, vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi, promícháme a necháme rozvařit v autoklávu. (Potřebné množství agaru je třeba u každé šarže otestovat). 2. Do Erlenmeyerovy baňky odměříme 500 ml destilované vody. 3. Přidáme koncentrát makroelementů (100 ml), mikroelementů (10ml) a chelát železa (5 ml). 4. Přidáme vitamíny (1 ml zamraženého koncentrátu). 5. Navážíme 100 mg inositolu. 6. Navážíme 20 g sacharózy. 7. Podle potřeby doplníme další látky jako aktivní uhlí, růstové regulátory apod. 8. Slijeme rozvařený agar se zahřátým roztokem v EM baňce a doplníme v odměrném válci na 1000 ml ohřátou destilovanou vodou. 9. Pomocí Phan papírků nebo pH metru změříme pH a upravíme na 5,8 pomocí 0,1 M KOH nebo 0,1 M HCl. 10. Médium dobře promícháme přeléváním z válce do EM baňky a rozlijeme asi po 40 ml do kultivačních nádob. 11. Kultivační nádoby s médiem uzavřeme vhodným uzávěrem. 12. Následující den sterilizujeme při 121°C v autoklávu po dobu 20 minut. 13. Krátkodobě média uchováváme při laboratorní teplotě, při skladování po delší dobu používáme lednici. B. Příprava 1 litru agarem ztuženého média s použitím hotové směsi 1. Navážíme 5,5 g agaru, vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi, promícháme a necháme rozvařit v autoklávu. 2. Do Erlenmeyerovy baňky odměříme 600 ml destilované vody. 3. Přidáme odvážené množství média (podle údajů výrobce na etiketě). 4. Navážíme 20 g sacharózy. 5. Podle potřeby doplníme další látky jako aktivní uhlí, růstové regulátory apod. 6. Slijeme rozvařený agar se zahřátým roztokem v EM baňce a doplníme v odměrném válci na 1000 ml. 7. Pomocí Phan papírků nebo pH metru změříme pH a upravíme na 5,8 pomocí 0,1 M KOH nebo 0,1 M HCl. 8. Další postup je shodný jako u A. varianty. Poznámka: Pokud jako kultivační nádoby používáme Petriho misky, mícháme médium i s navážkou agaru, sterilizujeme médium v celém objemu a rozléváme do sterilních misek v laminárním boxu. Skleněné Petriho misky předem sterilizujeme v sušárně nebo autoklávu, plastové misky jsou v uzavřeném sáčku sterilní, jsou sterilizované g-zářením při výrobě. Reference: Gamborg O.L., Miller R.A. et Ojima K., Exp. Cell Res. 50, 151 (1968) – B5 Chu C.C. et al.,. Scientia Sinic., 18, 659 (1975) – N[6] Lloyd G. et McCown B., Int. Plant Prop Soc. Proc. 30, 421 (1980) - WPM Murashige T. et Skoog F., Physiol. Plant. 15, 473 (1962) - MS Nitsch J.P. et Nitsch C., Science 169, 85 (1969) - N Van der Salm T.M.P. et al., Plant Cell Tissue and Organ Cult., 37: 73-77 (1994) Tab. 1. Složení živných médií M-S (1962) B5 (1968) N (1969) Anorganické soli /mg/l/ /mg/l/ /mg/l/ Makroelementy KNO[3 ] 1 900 2 500 950 NH[4]NO[3] 1 650 720 (NH[4])[2]SO[4] 134 166 CaCl[2] . 2 H[2]O 440 150 MgSO[4] . 7 H[2]O 370 250 185 KH[2]PO[4] 170 68 NaH[2]PO[4] 150 Železo: Na[2]EDTA 37,3 37,3 37,3 FeSO[4] . 7 H[2]O 27,8 27,8 27,8 Mikroelementy MnSO[4] . 4 H[2]O 22,3 10 25 H[3]BO[3] 6,2 3 10 ZnSO[4] . 7 H[2]O 8,6 3 10 Na[2]MoO[4] . 2 H[2]O 0,25 0,25 0,25 CuSO [4] . 5 H[2]O 0,025 0,025 0,025 CoCl[2 ]. 6 H[2]O 0,025 0,025 KI 0,83 0,75 Organická složka Vitamíny inositol 100 100 100 kys. nikotinová 0,5 1 5 thiamin.HCl (B[1]) 0,1 10 0,5 pyridoxin . HCl (B[6]) 0,5 1 0,5 glycin 2 2 2 kyselina listová 0,5 biotin 0,05 sacharosa 15 000-30 000 agar 7 000 7 000 7 000 pH 5,7 5,7 5,8