Jméno:
Datum:

Téma 06a:  Iniciace kalusové kultury mrkve Daucus carota ssp. carota L.


Na segmentech různých orgánů většiny dvouděložných rostlin, obzvláště pokud jsou v segmentech
přítomny meristematické buňky primárního nebo sekundárního meristému (stonkový nebo kořenový
apikální meristém, kambium, felogén), se po inokulaci do vhodného média (většinou v přítomnosti
auxinu) začnou buňky poměrně rychle dělit a vznikají neorganizované shluky buněk, tzv. kalus. Méně
často se na tvorbě kalusu podílejí zralé, diferencované buňky.

Materiál: kořeny mrkve (karotky)         Daucus carota ssp. carota L.

Pomůcky:


Médium: 1D = MS základní soli, B5 vitamíny, sacharóza 20 g.l^-1, 2,4-D (0,1 mg/l),
               ztuženo 0,7% agarem, pH 5,7

Postup práce:

1.    Odstranit všechny nemocné, poškozené nebo nepravidelně utvářené kořeny.

2.    Vydrhnout kořeny mrkve malým kartáčkem a mýdlem pod tekoucí vodou, odstranit veškeré
povrchové nečistoty.

3.    Segmenty kořenů asi 10 cm dlouhé desinfikovat ve 20% roztoku SAVO ve sterilní destilované
vodě (SDV) (v/v) za mírného míchání 20 minut (třepačka).

4.    Oplachování 3x po dobu 3 minut v SDV, pro dostatečné odstranění desinfekčního roztoku.

5.    Přenos desinfikovaných segmentů ožíhanou pinzetou do sterilní Petriho misky.

6.    Sterilně v laminárním boxu ožíhaným skalpelem odříznout z každé strany kořenového segmentu 1
cm a segment přenést do další Petriho misky. Kontrolujte polaritu segmentu.



                            Obr.1.    Reinert et Yeoman (1982) upraveno


7.    Krájejte příčné řezy kořenem o tloušťce asi 2 mm a z nich připravte díly o velikosti asi 10 x
10 mm tak, aby obsahovaly ve střední části kambium. Velikost a tloušťka explantátů by měla být
jednotná. Tento postup opakujte, až získáte dostatečný počet explantátů pro pokus. Po každé
manipulaci uzavírejte víčko Petriho misky.

8.    Ožíhejte okraj víčka a po jeho sejmutí i okraj kultivační nádoby. Do každé kultivační nádoby
vložte 4 – 5 explantátů bazální řeznou plochou do agarového média 1D (MS, 2% sacharóza, 0,1 mg/l
2,4-D, 0,7% agar).

9.    Mezi jednotlivými operacemi odkládejte skalpel a pinzetu do 96% ethanolu a opakovaně nástroje
ožehávejte. Každý připraví 20 explantátů.

10. Po inokulaci ožíhejte opět okraj kultivační nádoby a uzavřete víčkem.

11. Zaznamenejte si počet segmentů v kultuře (v kultivační nádobě a počet nádob).

12. Kultivační nádoby umístěte do termostatu a kultivujte ve tmě při teplotě 25°C.


Hodnocení:

V následujících týdnech kontrolujeme čistotu kultur a vyhodnotíme četnost segmentů, na kterých
došlo k  iniciaci tvorby kalusu.


Téma 06b:  Pasážování kalusové kultury mrkve Daucus carota ssp. carota L.


Za 4 týdny se většinou na explantátu vytvoří výrazný kalus a každý explantát by měl být rozdělen na
2 – 3 části ne menší než 10 x 10 mm a přenesen na čerstvé médium. Buňky na spodní straně explantátu
jsou často nekrotické a nejsou vhodné pro další kultivaci. Tyto nekrotické části oddělte a
odstraňte.

Pokud pasážujeme již odvozenou kalusovou kulturu, odebíráme pinzetou nejmladší část kalusového
pletiva a inokulujeme ji na povrch čerstvého média. Pro udržení kalusové kultury používáme stejné
médium s 2,4-D, pro iniciaci tvorby somatických embryí v kalusu auxin v médiu vynecháme.

Pomůcky:



Postup:
 1. Přenést kultury z termostatu do laminárního boxu.
 2. Ožehnout okraj uzávěru a po jeho sejmutí i okraj kultivační nádoby.
 3. Ožíhanou pinzetou vyjmout explantát a přenést jej do sterilní Petriho misky.
 4. Po rozdělení inokulovat explantáty do zkumavky s čerstvým médiem.
 5. Ožehnout hrdlo kultivační nádoby a uzavřít víčkem.
 6. Poznamenat datum a pořadí pasáže.


    Plánovaný postup

                                         Dny od počátku pokusu

    Izolace čerstvých explantátů z kořene

                                                                                          0

    První pasáž

                                                                                         28

    Výrazná proliferace kalusu

                                                                                       42 – 48

    Izolace vlastního kalusu

                                                                                       91 – 98

    Perioda pasážování kalusu

                                                                                       4 týdny


Výsledky:

Zaznamenejte do protokolu detaily pokusu = datum počátku iniciace kalusové kultury, počet
explantátů, počet kultur, četnost infekcí, různé použité postupy. Kultury kontrolujte
v pravidelných týdenních intervalech a zaznamenejte změny v jejich morfologii. Popište průběh
experimentu.


Otázky:
 1. Ze kterého pletiva primárního explantátu pochází kalus?
 2. Rostou všechny explantáty stejně? Jaké důvody mohou vést k rozdílnému vývoji explantátů?


Literatura:

Reinert J. et Yeoman M.M. (1982) Plant Cell and Tissue Culture. – Springer-Verlag, Berlin