Typy populačně-genetických dat a jejich základní analýza



Fylogenetika vs. populační genetika
ACGTTTCT
ACGTTTCT
ACGATTCT
ACGATTCT
ACGATTGT
ACGTTTCT
ACGTTTCA
ČAS
ACGATTCT
ACGATTGT
ACGTTTCT
ACGTTTCT
- mutační rychlost - datování
- fylogenetické vztahy mezi jednotlivými variantami
- selekce na úrovni kódujících sekvencí
- většinou nás nezajímají frekvence alel
ACGATTGT
ACGATTGT
ACGATTGT
ACGATTCT
ACGTTTCA
ACGTTTCT
ACGTTTCA
ACGTTTCT
- založená na frekvencích alel
- relativně recentní procesy: genetický drift, populační struktura, tok genů, efektivní velikost
populace
- selekce – srovnání populační struktury na kódujících a nekódujících znacích

Laboratorní techniky
(= typy genetických markerů)
Př.: chromozóm 1
„single-locus“
(PCR, microarrays)
„multi-locus“
(dominantní znaky)

Typy populačně-genetických dat
Jedinec
Marker 1
Marker 2
Ind_1
170/172
133/136
Ind_2
168/172
133/139
Ind_3
168/168
136/139
Jedinec
Marker 1
Marker 2
Ind_1
A/T
C/T
Ind_2
A/T
T/T
Ind_3
T/T
C/T
Jedinec
Marker 1
Marker 2
Ind_1
+/-
-/-
Ind_2
+/+
+/+
Ind_3
-/-
+/-
Jedinec
Marker 1
Marker 2
Ind_1
+
-
Ind_2
+
+
Ind_3
-
-
mikrosatelity
SNPs
SINE
AFLP

•Jak je variabilní daná populace a jaká je její efektivní velikost
•
•Nachází se daná populace v období demografické expanze nebo poklesu?
•
•Existuje mezi dvěma subpopulacemi bariéra toku genů a jak je silná? Jaká je prostorová genetická
struktura?
•
•Vyskytují se v populacích imigranti nebo jejich potomci (hybridi)?
•
•Jaká je příbuzenská struktura populace a došlo v ní k inbreedingu?
Populačně-genetická analýza

Populačně-genetická data
- v tomto kurzu omezena na diploidní kodominantní znaky (Mendelovská dědičnost)
CCGATCAATGCGGCAA
CCGATCACTGCGGCAA
T
G
mikrosatelity
jaderné sekvence
(např. SSCP)
SNPs

Velké množství populačně-genetických programů



Kodominantní znaky (např. mikrosatelity) – GenAlEx formát
počet lokusů
počet jedinců
počet populací
počet vzorků v 1. populaci
počet vzorků v 2. populaci, atd.
genotypy, tj. velikosti fragmentů u jednotlivých jedinců
geografické koordináty
pop1
pop2

Genepop file format – jednoduchý ASCI kód (.txt)
- jednotlivé alely pro daný lokus jsou seřazeny podle velikosti a očíslovány
- tj. např. 128/130 je převedeno na 10/11

Vnitropopulační variabilita
•Polymorfismus
•podíl polymorfních lokusů (znaků) – např. 0,8 = 4 z pěti zkoumaných mikrosatelitů mají v populaci
alespoň 2 alely, z nichž ta vzácnější dosahuje frekvence alespoň 1% nebo 5%
•
•Počet alel (number of alleles)
•počet alel na lokus
•
•Alelická bohatost (allelic richness)
•počet alel na lokus vztažený k velikosti vzorku (metodou „rarefaction“) - FSTAT
•
•Pozorovaná heterozygotnost (observed heterozygosity)
•průměrná četnost heterozygotů v jednotlivých lokusech
•
•
Sample size

Hardy-Weinbergova rovnováha (HWE)
Alela
Četnost alely
170
p
172
q
Př. Jeden lokus se 2 alelami
p + q = 1
p, q  - zjistíme analýzou svých vzorků
Genotyp
Očekávaná četnost genotypu
170/170
p2
170/172
2pq
172/172
q2
= Hardy-Weinbergova rovnováha
        (p2 + 2pq + q2 = 1)
Ø četnosti genotypů zjistíme analýzou svých vzorků
Ø odchylky od očekávaných četností Þ test HWE (např. c2 test nebo exact probability test v Genepop)
Očekávaná heterozygotnost (expected heterozygosity, He) při HWE
He=1-(p2+q2) ..... pro 1 lokus se 2 alelami s četností p a q
 = rozmístění alel do genotypů v rovnovážné populaci

Předpoklady HWE
•náhodné párování (panmixia)
•zanedbatelný efekt mutací a migrací („closed populations“)
•nekonečně velká populace
•Mendelovská dědičnost použitých markerů
•neutrální znaky – žádná selekce
•
•znaky nejsou ve vazbě – kontrola na „linkage disequilibrium“ (vazebná nerovnováha; speciální test
např. v Genepop)
•
2 lokusy ve fyzické blízkosti
(snížená pravděpodobnost rekombinace
linkage disequilibrium)
vs.
2 lokusy fyzicky vzdálené
(pravděpodobnost rekombinace není ovlivněna
linkage equilibrium)
nebo

Odchylky od HW rovnováhy
•Test HWE – např. Genepop („exact probability tests“) – pokud jsou odchylky, tak některý předpoklad
HWE nebyl splněn
•
•nadbytek heterozygotů = negativní asortativní páření (tj. cílené rozmnožování nepodobných jedinců)
– použité lokusy mohou být výhodné v heterozygotním stavu (např. geny MHC)
•
•nedostatek heterozygotů
•inbreeding (postihuje všechny lokusy stejně)
•vnitřní struktura („Wahlundův efekt“)
•nulové alely (jen na některých lokusech bude deficit heterozygotů) - FreeNA

Null alleles
nnulové alely (mutace v primerových sekvencích) → vyšší proporce „homozygotů“
TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA
TTCAGGCACACATCTCTAGCTTTGA
x
PCR OK
no PCR

Příklad – stanovení variability populace
Jedinec
Locus 1
Locus 2
Locus 3
Locus 4
Průměr
Ind 1
170/170
223/227
116/116
316/316
Ind 2
170/172
223/225
112/112
316/316
Ind 3
172/172
223/225
112/112
316/316
Ind 4
170/172
223/227
112/112
316/316
Počet alel
2
3
2
1
2
Ho
0,5
1,00
0
0
0,375
p
0,5
p = 0,5
0,75
1,00
q
0,5
q = 0,25 r = 0,25
0,25
0
He
0,5
0,625
0,375
0
0,375
He=1-(p2+q2)
He=1-(p2+q2+r2)
Polymorfismus = 0,75

Genetická variabilita (He) jako ukazatel efektivní velikosti populace (Ne)
•neutrální genetická teorie: He=4Neµ/[4Neµ+1]
•
•mutation-drift equilibrium
•
br05f01
Čím je populace větší, tím má vyšší genetickou variabilitu

Efektivní velikost populace (Ne)
•Ne = velikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou
diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace (vlivem náhody)
•ovlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou příbuzenského křížení atd.
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg

Efektivní velikost populace (Ne)
•Ne = velikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou
diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace (vlivem náhody)
•ovlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou příbuzenského křížení atd.
<
Ne
•vývoj genetické variability v malých populacích závisí na Ne více než na N
•
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg
http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg

Důsledky poklesu Ne
He=4Neµ/[4Neµ+1]
Pokles pozorované variability (He – odhadnuta z tzv. genetických znaků) = pokles Ne
Pokles adaptivní variability

„Budoucnost je v genech ...“
•Změny prostředí (např. klima, patogeny, aj.) → přizpůsob se nebo zmiz!
•Vysoká genetická variabilita znamená, že je zde více genetických variant, z nichž některé mohou
být vhodné pro nové podmínky
•Populace s vyšší genetickou variabilitou mají „více losů v loterii“ (= adaptivní potenciál)
•
•
•
•
•
•
•
Dryas octopetala v Alpách, Německo. Photo: Steve Smith

Low genetic diversity is also a problem for the future, because genetic variation can help
populations adapt to new conditions. Currently, climate change is forcing species to adapt to new
conditions, or else move away. Higher genetic diversity means there are more genetic alternatives
that might be suited to the new conditions. In a way, possessing higher genetic diversity provides
a population with more 'tickets in the lottery’ so that by chance, one of the gene variants will be
suited to the new conditions.

Genetická struktura populací
drift, mutace
•Drift
→ diferenciace subpopulací
díky změnám frekvencí (až fixaci) alternativních alel
•
•
•Mutace
mohou zvýšit diferenciaci
(nebo ne – homoplázií)
•
•
AA
AA
AA
AA
AA
AA
aa
Aa
AA
aa
Aa
AA
aa
Aa
Aa
aa
AA
AA
aa
aa
aa
aa
aa
aa
Aa
Aa
Aa
Aa
drift
Migrace (genový tok)
- působí proti diferenciaci subpopulací
AB
ac

Vliv populační struktury na heterozygotnost
•Wahlundův princip
•
•Dvě izolované subpopulace s fixovanými alelami
•
•Subpopulace v HW, celkově v populaci však nedostatek heterozygotů
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa
aa

Wahlundův princip - příklad
•Jezero Bunnersjöarna (severní Švédsko) – „brown trout“
•2 alely na jednom znaku
170/170
170/172
(= Ho)
172/172
Total
p
2pq
(=He)
Přítok
50
0 (0)
0
50
1.000
0.000
Odtok
1
13 (0.26)
36
50
0.150
0.255
Celé jezero
(expected)
51
(33.1)
13 (0.13)
(48.9)
36
(18.1)
100
0.575
0.489
Ryman et al. 1979
p2 = 0.5752
q2 = 0.4252

Výpočet FST – snížení heterozygotnosti v důsledku bariéry mezi subpopulacemi
Ryman et al. 1979
V důsledku bariéry toku genů je heterozygotnost o 72.8% nižší než by byla v panmiktické populaci
170/170
170/172 (=Ho)
172/172
Total
p
2pq (=He)
Přítok
50
0 (0)
0
50
1.000
0.000
Odtok
1
13 (0.26)
36
50
0.150
0.255
Celé jezero
(expected)
51
(33.1)
13 (0.13)
(48.9)
36
(18.1)
100
0.575
0.489

Factorial correspondence analysis
- each locus as one variable, reduction of number of variables
- Genetix – orientační zjištění strukturovanosti populace
- individuals vs. populations

Bayesian clustering approach
STRUCTURE - Pritchard et al. 2000
... Když předem strukturu neznáme
•Neznámý počet populací charakterizovaných různými frekvencemi alel → počet populací a frekvence
zjišťuji
•Současně přiřazuji individua do populací
•Lokusy, které nejsou ve vazbě, HW uvnitř subpopulací  (např. mikrosatelity, SNPs)
•Model se snaží vyložit HW nebo vazebnou nerovnováhu zavedením populační struktury

K7
„Barplot“ pro K = 7
„Proporce genomu“ každého jedince náležející určitému „clusteru“
STRUCTURE – když předem strukturu neznáme
Existuje i jednodušší „non-admixture model“

Alternativní vizualizace výsledků ze STRUCTURE
„forced clustering“
Zobrazení hierarchické struktury mezi populacemi
Bartáková et al. 2013

•Q-values pro celé populace (ne jedince)
Bartáková et al. 2013


Example: Microsatellite data






Example: ddRAD data



Sekvenování podél restrikčních míst
(Enriched libraries by restriction enzymes)

Fragmetace gelogenomové DNA pomocí restrikčních enzymů
Ligace sekvenačních adaptorů na výsledné fragmenty
Následná sekvenace podél restrikčních míst
Celogenomové scany genetické variablility
Hledání SNPs, populační genomika (např. RAD-SEQ) apod.
ddRAD sequencing

ddRAD library
o tuto sekvenci nám jde!
sekvenační primery
Illumina adapter
Illumina adapter
identifikace vzorku (jedince)

Data analysis in ddRADseq
program Skewer
program iPyrad
- stovky až desítky tisíc lokusů

Output files
•"alleles" - complete data
•"snps" - only variable positions
•"usnps" - random selection of 1 SNP/locus

Phylogeny of concatenated data

Fig. 4. Maximum likelihood phylogenetic tree (RAxML) inferred from the concatenated dataset of
66,577 loci (503,746 SNPs) genotyped by the ddRAD approach. Black dots show nodes with the maximum
bootstrap support (BP=100). Bars on the right side show delimitations of MOTUs from the
branch-cutting of this ML tree and from the InfoMap clustering based on the coancestry matrix
(shown in Fig. 5).

Coancestry matrix



Next analyses ...
•STRUCTURE
•multi-species coalescence - species (MOTU) delimitations •GWAS ("genome-wide association studies")
•and many others, depending on the aims of research