Mechanizmy rezistence
na antimikrobika
update 2022
L.Pokludová MU_CZ
U většiny antibiotik a mikroorganizmů, není rezistence na atb způsobena jedním mechanizmem, často
dochází ke kombinaci mechanizmů nebo alespoň ke kombinaci účinků působících enzymů.

4 základní mechanizmy
nebo „strategie rezistence“
nZměna cílové struktury (Target alteration)
nzměna v místě působení atb
n
nNepropustnost nebo snížená propustnost + eflux
nZměna propustnosti – permeability, jiná než eflux
n   (Impermeability, discreased permebility)
nEffluxní pumpy
n   (Active transport outside of bacterial cell)
n
nEnzymatická inaktivace antibiotika (Enzymatic inactivation)
n
nHyperprodukce cílové struktury (Target amplification)
n
n
n

Modely typů rezistence na atb



Modely typů rezistence dle mechanismů a ATM
Dutta D, Kaushik A, Kumar D andBag S (2021) Foodborne PathogenicVibrios: Antimicrobial
Resistance.Front. Microbiol. 12:638331

Komentář k předchozímu obrázku- model patogenních Vibrií
Mechanizmy intrinsic (přirozené)  či acquired (získané) rezistence či snížené citlivosti
1.Snížený příjem ATM
2.Zvýšený efflux léčiv včetně ATM
3.Modifikace cílové struktury ATM (chromosome associated phenomenon),
4.Enzymatická inaktivace
5.Alterace metabolické dráhy
6, 7 a 8 reprezentují horizontální přenos AMR (mobilní genetické elementy - prostřednictvím
konjugace, transformace či fágové transdukce
9, 10, a 11 reprezentují plasmidový transfer či mobilní genetické elementy: transposony a integrony
12 Fyzikálně chemické procesy – např. v důsledku tvorby biofilmu mohou rovněž hrát roli při vzniku
a šíření AMR
Mechanizmy 6-12 představují vyšší a rychlejší přenos AMR s klinickými dopady
Bledě modré bublinky – cíle zásahu ATM
Červené tečky – koncentrace ATM odpovědné za buněčný influx nebo efflux pomocí bleděmodrých
transportérů nebo effluxních proteinů
Antibiotika (ATM) jsou vyjmenována ve fialových obdélnících
Pl = plasmid, Chr = chromozom

Změna cílové struktury - změna v místě působení atb:
nBakterie mění strukturu cílové molekuly zásahu antibiotika,
nobvykle esenciálního bakteriálního enzymu, nebo
nexprimuje alternativní cílovou molekulu neinhibovanou antibiotikem tím se vyhne toxickému účinku
antibiotika („bypass“ pathway)
nTato vlastnost není zcela specifická, ale může být společná pro více antibiotik se stejným nebo
příbuzným mechanizmem účinku.
n
n

Impermeabilita – změna propustnosti – permeability :
nBakterie mění propustnost :
núplnou impermeabilitou pro antibiotikum nebo
naktivním vyloučením antibiotika z buňky.
n
nTato vlastnost může být přísně
nspecifická:
nchybění specifických receptorů nebo
nchybění porinů pro propuštění atb do buňky
nnespecifická
nblok ATP systému a zábrana aktivního transportu do buňky v závislosti na konkrétním mechanizmu.

Enzymatická inaktivace antibiotika :
n Bakterie produkuje enzymy, které inaktivují antibiotikum :
npozměněním struktury a funkčnosti
npřímým štěpením a zničením funkčnosti
n
nTato vlastnost bývá vysoce specifická :
nodpovídající inaktivační enzym přesně stereospecificky odpovídá danému substrátu – zde
antibiotiku.
n

Hyperprodukce cílové struktury
n
nBakterie produkuje cílový enzym v takovém množství, že jej nelze danou koncentrací antibiotika
vyblokovat.
n

Mechanizmy rezistence a antibiotika,
u kterých se uplatňují
https://asmsig.files.wordpress.com/2012/11/mechanisms-of-resistance-and-antibiotics1.jpg

n
n
nZměna cílové struktury
npůsobení antimikrobika

Změna cílové struktury –
Změna lokusu NK, na kterém dochází k vazbě atb
nRezistence k rifampicinu
nbodová mutace DNA-dependentní RNA polymerázy
n
nPříkladem tohoto mechanizmu je R k rifampicinu u  Mycobacterium tuberculosis
nCíl : β-podjednotka RNA-polymerázy kódovaná genem rob.
nVzniká s vysokou frekvencí
nMechanizmus zahrnuje bodové mutace, delece a inzerce,
n„single step“ high level resistance.
n
nZdroj : Bacterial resistance to antibiotics: Modified target sites, P.A. Lambert/ Advanced Drug
Delivery Reviews 57 (2005) 1471-1485)
n
nObdobný mechanizmus se změnou v genu rpoB  byl popsán také u vysokého nárůstu R k rifampicinu u
kmenů Helicobacter pylori a E.coli.
n
nRezistence k sulfonamidům
nbodová mutace v lokusu genu kódujícím syntetázu dihydropteroátu – snížená afinita k sulfonamidům a
zvýšená ke kyselině p-aminobenzoové
n

Změna cílové struktury –
Změna lokusu NK, na kterém dochází k vazbě atb
n
nRezistence k fluorochinolonům
nMůže vzniknout chromozomálními mutacemi jak DNA gyrázy tak topoizomerázy IV.
n
nU  gramnegativních bakterií rezistentních na fluorochinolony dochází:
nk alteraci buď GyrA nebo GyrB podjednotek DNA gyrázy.
nK mutaci dochází v tzv. „oblasti determinující R k chinolonům“ (= QRDR … quinolone resistance
determining region).
n
nsoučasný výskyt mutací GyrA a parC => velmi vysoký stupeň rezistence k chinolonům
nnapř. 2 modifikace v místě GyrA+ 2 modifikace v místě parC => obrovský nárůst MIC ciprofloxacinu,
pohybuje se v rozmezí 16 až 32 mg/l … pro srovnání snížená citlivost ciprofloxacinu v přítomnosti
jediné modifikace vede k MIC 0,25 mg/l.
nGyrB mutace jsou méně časté, mechanizmus způsobující rezistenci není zcela objasněn.
n
n
nU  grampozitivních bakterií změna topoizomerázy IV
n Zde se jedná o chromozomální mutace zasahující především oblasti parC a parE.
n
n

Změna cílové struktury
Exprese alternativní cílové molekuly neinhibované antibiotikem
nPlazmid poskytuje buňce náhradní enzym, který je odolný proti účinku antimikrobní látky.
nJeden enzym je např. kódován chromozomálně a je k atb citlivý, při jeho „napadení“ je zastoupen
enzymem kódovaným plazmidově, který je odolný k atb.
n
nBypass pathway
nJe volena jiná metabolická dráha, kterou přítomnost antibiotika nenaruší.
n
nRezistence k trimetoprimu
nalterace reduktázy dihydrofolátu => alterace je provedena náhradou enzymem kódovaným dfr genem
neseným plazmidem nebo jiným mobilním elementem – např. transpozónem nebo genovou kazetou) +
snížená permeabilita.
nMechanizmus popsán u  St.aureus, Str. pneumonie  a  H.influenzae)
n

 Změna cílové struktury
Změna cílového místa enzymu účastnícího se základních metabolických pochodů, což má za následek
rezistenci k danému atb
nRezistence k β-laktámům - alterace cílových struktur : PBP
n (PBP = penicillin binding proteins)
n změněná afinita PBP k β-laktamovým antibiotikům:
nMRSA, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae,Helicobacter pylori, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes
nProteus mirabilis, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa  kromě změněné afinity PBP také
eflux a narušení permeability
n
nZ klinického a epidemiologického hlediska zejména z pohledu problematiky nozokomiálních infekcí je
velmi důležitá
nREZISTENCE K OXACILINU A METICILINU U KMENŮ STAFYLOKOKŮ

REZISTENCE K OXACILINU A METICILINU U KMENŮ STAFYLOKOKŮ
nMRSA získávají vysokou rezistenci k meticilinu a k jiným β-laktamům prostřednictvím získání a
exprese mecA genu.
nTento gen kóduje protein PBP 2a (patří do skupiny biosyntetických enzymů podílejících se na
začleňování peptidoglykanových komponent do buněčné stěny).
nGen  mecA  je nesen na velkém genetickém elementu, který bývá nazýván stafylokokovým kazetovým
chromozómem mec (SCCmec), který je integrován do chromozómu MRSA v blízkosti počátku replikace.
nPředpokládá se, že SCCmec byl získán prostřednictvím horizontálního genového přenosu z kmenů
koaguláza-negativních stafylokoků, pravděpodobně veterinárních kmenů Staphylococcus sciuri.

REZISTENCE K OXACILINU A METICILINU U KMENŮ STAFYLOKOKŮ
nV současnosti se rozlišuje 5 základních typů SCCmec (označ. I až V) a několik jejich variant.
nLiší se složením i velikostí (21 – 67kb).
nLze je identifikovat PCR technikami.
nInterakce mezi β-laktamovým antibiotikem a PBP zahrnuje:
nrychlé reverzibilní vytvoření nekovalentního komplexu,
nnásleduje nukleofilní atak na β-laktamový kruh prostřednictvím kyslíku z postranního řetězce
zbytku serinu přítomného v aktivním centru enzymu.
nTak se vytvoří relativně stabilní kovalentní komplex, ve kterém je serin acylován hydrolyzovaným
β-laktamem.
nDalší mechanizmus je vysvětlován pomocí kinetického modelu.
nV různém stádiu vývoje jsou nyní léčiva, jejichž účinek je založen na principu uchování afinity
k PBP 2a a možnosti překlenout tento mechanizmus rezistence. Patří mezi ně například modifikované
cefalosporiny, karbapenemy a trinem.
n
n

Další příklady změny enzymů
nMozaikové PBP u kmenů Streptococcus pneumonie
nPBP se sníženou afinitou k β-laktamům.
nzpůsobující rezistenci ke třetí generaci cefalosporinů nebo modifikované PBP 2a u rezistence
k penicilinům.
n
nAlterované PBP u kmenů Neisseria gonorrhoeae
nN.gonorrhoeae  má 4 druhy PBP, označované PBP 1, 2, 3 a 4.
nVysoká rezistence k penicilinu + spojení s dalšími systémy - efluxní systémy a alterace porinů
vnější membrány, které působí spolu se změnami na PBP.
n
nMozaikové PBP u kmenů Neisseria meningitidis
nGen penA  produkce PBP 2 s nízkou afinitou k penicilinům, zčásti je tento gen shodný s geny N.
flavescens a N.cinerea – tyto druhy jsou přirozeně rezistentní k penicilinu a jsou to komensálové,
může však docházet k výměně genetické informace.
n
nNízká afinita k PBP u enterokoků
nPBP enterokoků mají přirozeně nízkou afinitu  k penicilinům a žádnou k cefalosporinům.
nMají 5 druhů PBP. Prostřednictvím mutací a rekombinantních mechanizmů dochází k minimalizaci
afinity PBP (zejména PBP typu 5) k penicilinům a tím k projevu vysoké R k penicilinům.
n
nZdroj:Bacterial resistence to antibiotics:Modified target sites, P.A. Lambert/Advanced Drug
Delivery Reviews 57 (2005) 1471 – 1485).
n

Změna cílové struktury
Ribozomální modifikace
nZměny 23S rRNA a změna proteinů 50S ribozomální podjednotky
nRezistence ke skupině „MLS“ (makrolidy, linkosamidy, streptogramin B)
nje způsobena posttranskripční modifikací 23S rRNA komponeny 50S podjednotky ribozómu, která
zahrnuje metylaci a dimetylaci klíčových adeninových bazí v oblasti funkční domény
peptidyltransferázy.
nMetylace je katalyzována adeninspecifickými N-metyltransferázami determinovanými skupinou genů
erm, která je přítomna u mnoha typů mikroorganizmů a je nesena na plazmidu.
n
nRezistence k makrolidům u  Streptococcus pneumoniae
nmodifikace způsobuje enzym metyláza prostřednictvím dimetylace adeninu – výsledkem je rezistence
na makrolidy, linkosamidy a streptograminy typu B.
nproti tomuto mechanizmu rezistence je odolný nový ketolid telithromycin.
n
nMechanizmus rezistence na oxazolidinony
nje založen na mutaci zasahující 23S r RNA a byl popsán u VRE (vankomycin rezistentní enterokoky) a
u kmenů  E.coli.
n

Změna cílové struktury
Ribozomální modifikace
nZměny 16S rRNA a změna proteinů 30S ribozomální podjednotky
n
nJeden z mechanizmů rezistence na aminoglykosidy je způsoben mutací zasahující 16 S rRNA, jedná se
o změny na pozicích 1400, 1401 a 1483,
nnejčastěji byla např. u kmenů mykobakterií zaznamenána výměna  A za G v pozici 1400.
nSubstituce na dalších pozicích byly popsány u kmenů mykobakterií s rezistencí na streptomycin a
další aminoglykosidy (amikacin, kanamycin, gentamicicn, tobramycin a neomycin).
n
n
n

Změna cílové struktury
Změny peptidoglykanu
nSnížené množství peptidoglykanu v buněčné stěně a alterované stem peptidy
n
n popsán u rezistence na vankomycin.
n zaznamenána např. u kmenů stafylokoků (VRSA… GRSA = vancomycin resistant St.aureus) a u kmenů
s intermediární rezistencí (VISA … GISA = vancomycin intermediate-resistant St.aureus).
nPři porovnání s kmeny citlivými ke glykopeptidům, zjistili bychom například :
nřada změn v metabolismu jejich buněčné stěny včetně dvojnásobného nárůstu tloušťky buněčné stěny,
nnárůst proporce peptidoglykanových stem peptidů obsahujících zbytky glutaminu (non-aminated
glutamine) a
nsnížená provázanost peptidoglykanové struktury.
nO těchto faktorech je známo, že způsobují intermediární rezistenci k vankomycinu prostřednictvím
afinitních chytacích (trapping) mechanizmů. U silnější buněčné stěny s mnoha vazebnými místy pro
vankomycin bylo prokázáno, že „chytá“ molekuly antibiotik a tak snižuje počet molekul vankomycinu,
které prostoupí až k cytoplazmatické membráně, kde jsou umístěny transglykosylátové cíle (…
prostřednictvím těchto cílů účinkují glykopeptidy na b.s. bakterií zábranou inkorporace
D-Ala-D-Ala).
n

Změna cílové struktury
Modifikace prekurzorů peptidoglykanu
nNejčastější příčina rezistence na glykopeptidy u kmenů E. faecium a E.faecalis
n
nzískání jednoho nebo dvou genových klastrů nazývaných VanA a VanB.
nTyto genové klastry kódují enzymy -producenty modifikovaných prekurzorů peptidoglykanu končící
D-Ala-D-Lac místo D-Ala-D-Ala.
nRezistence ke glykopeptidům v důsledku exprese genů VanA a VanB klastrů je indukována přítomností
glykopeptidových antibiotik, procesem, který je regulován dvousložkovým regulačním mechanizmem
vanRS a  vanRB SB.
nGenové klastry zodpovědné za VanA a VAnB rezistenci jsou lokalizovány na přenosných elementech a
na šíření těchto elementů na další kmeny v rámci rodu  Enterococcus  se může podílet jak
transpozice tak přenos plazmidů.
nIntrinsic rezistence byla popsána u  E.caselliflavus  a  E.gallinarum  a byl zde detekován klastr
VanC.
nRaritní je výskyt rezistence a determinant VanD, VanE a VanF.
n

Změna cílové struktury
Modifikace prekurzorů peptidoglykanu
nV roce 2002 byl poprvé zjištěn MRSA kmen Staphylococcus aures  s vysokou rezistencí na
glykopeptidy (MIC = 32 mg/l)
nu  něj popsána determinanta VanA získaná od enterokoků.
nPřítomnost dvou odlišných typů mechanizmů rezistence na antibiotika u téhož kmene :
nSCCmecA na chromozómu a Van A klastru na plazmidu =>
n velké změny ve složení peptidoglykanu.
nByly tak objeveny dva genové klastry, které používají různé sady enzymů pro dosažení modifikace
peptidoglykanu.
nV procesu klinického hodnocení  - nová antibiotika účinná na VRE a MRSA kmeny a vykazují zároveň
zlepšené farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti :
nORITAVAMYCIN (derivát chloroeremomycinu – analog vankomycinu),
nTELAVANCIN (analog vankomycinu)
nDALBAVANCIN (analog teikoplaninu s vylepšenými vlastnostmi adsorpcí, distribucí a metabolismem a
exkrecí).

Změna cílové struktury –
další mechanizmy
n
n                      Rezistence k izoniazidu způsobená změnami v syntéze kyseliny mykolové
nGeny katG, inhA a kasA u klinických izolátů Mycobacterium tuberculosis rezistentních na INH. Dva
důležité enzymatické cíle zásahu INH jsou inhibovány:
nNADH – dependentní enoyl ACP reduktáza kódovaná genem inhA
nΒ-ketoacyl ACP syntéza kódovaná genem kasA
nZtráta účinnosti pyrazinamidázy v důsledku mutace pncA genu
nZtráta účinnosti pyrazinamidázy vede k rezistenci na pyrazinamid u kmenů Mycobacterium
tuberculosis. Mechanizmus účinku spočívá v hydrolýze pyrazinamidu uvnitř buňky a selhání efluxu
výsledné pyrazonové kyseliny, což vede k acidifikaci vnitřního prostředí buňky, která způsobí její
smrt.
nZměny izo-leucyl-tRNA syntetázy vedoucí k rezistenci na mupirocin
nvysoká hladina rezistence k mupirocinu je způsobena plazmidem přenášeným genem mupA nesoucím
informaci o druhotné mupirocin rezistentní izo-leucyl-tRNA syntetáze. Nízká hladina rezistence
naopak vzniká bodovou mutací na chromozomálně lokalizovaném genu ileS. Popsáno u kmenů St.aureus.
nElongační faktor G
nRezistence kmenů St.aureus  vzniká v důsledku alterace EF-G cílového místa.
nJe způsobena bodovou mutací chromozomálního genu fusA  kódujícího EF-G.
nLipopolysacharidy
nChemická modifikace interakce polymyxinové antibiotikum + lipopolysacharid.
nV oblasti lipidu A dochází k modifikaci diglukosaminových komponent a jejich provázanosti s estery
fosfátů. Popsáno u gramnegativních bakterií.

nZměny průniku ATM do buňky:
n
nImpermeabilita
-Mechanicky
-Energeticky
-
nEfflux (aktivní vyloučení)
-
-

Impermeabilita
nMECHANICKÉ ZABRÁNĚNÍ PRŮNIKU ATB DO BUŇKY
nZměna molekuly přenašeče
nZměna prostorové konfirmace vedoucí k zúžení porinového kanálu a tím bloku průniku antibiotika.
nAlterace aktivního transportního proteinu
nZměnou v aktivním centru transportního enzymu se není schopno antibiotikum navázat a není
transportováno do prostoru buňky.
nZměnou charakteru povrchu buňky modifikace lipopolysacharidů
nModifikace lipopolysacharidů (LPS) zachycením polykationických sloučenin nebo mutací vede ke
zvýšení rezistence k hydrofobním atb
nZabránění průniku antibiotika do buňky pomocí porinů
nAntibiotika jako β-laktamy, chloramfenikol a fluorochinolony pronikají přes membránu
gramnegativních mikroorganizmů přes poriny. Proto změny v počtu porinů, jejich velikosti a
selektivitě vedou ke změně propustnosti výše uvedených antibiotik
nprvní kolo „selekce průniku“ je podle velikosti atb, další podle náboje
nizoláty rezistentní na β-laktamy většinou kombinují mechanizmus ztráty odpovídajících porinů a
enzymatickou likvidaci pomocí betelaktamáz , někdy ale také postup může spočívat ve „zúžení“
porinového kanálu
n

Impermeabilita
n
nENERGETICKÝ DEFICIT – OVLIVNĚNÍ SYSTÉMU ATP
n
nje-li atb přenášeno aktivním transportem – vyžaduje to energii – mutací nebo plazmidově kódovanou
informací může dojít k ovlivnění tvorby ATP, což má za následek snížení nebo zastavení transportu
atb do bakteriální buňky
n

Impermeabilita
n
nELIMINACE NEBO AKTIVNÍ VYLOUČENÍ ATB:
n
nSystémy efluxních pump vylučují léčiva různých chemických a strukturálních skupin vně bakteriální
buňky pomocí na energii závislých bakteriálních mechanizmů, aniž by byla léčiva rozkládána nebo
alterována.
nEfluxní transportéry tvoří asi 6 až 18 % všech transportních systémů bakteriální buňky.
n

Efflux
nTyto systémy lze také rozlišit na:
njednosložkové systémy – transport přes cytoplazmatickou membránu
nhlavně u grampozitivů
neflux makrolidů a fluorochinolonů
npříklady - NorA u St. aureus – fluorochinolony
nMefA Str.pyogenes – makrolidy
nMefE Str. pneumoniae - makrolidy
nvícesložkové systémy – spojené s periplazmatickým membránovým proteinem
nfúze (MFP) a proteinem vnější membrány (OMP),
nvýskyt u gramnegativních mikroorganizmů
nhlavní mechanizmus RND
n

Bacterial Multidrug Efflux Pumps: Much More Than
Antibiotic Resistance Determinants, Blanco P. et al, 2016


PRINCIP  AKTIVNÍHO  EFLUXU
nEnergeticky závislý systém, vázaný na membránové specifické proteiny
nV současnosti je známo 5 základních systémů aktivního efluxu :
n
n(a)   Major facilitator superfamily (MFS)
n(b)   ATP – binding casette (ABC) superfamily
n(c)    Small multidrug resistence (SMR) family
n(d)   Resistence-nodulation-cell division (RND) superfamily
n(e) Multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family

Major facilitator superfamily (MFS)
nVelká a různorodá skupina
nzahrnuje asi tisíc transportérů:
nkatalyzují uniport, symport látka / kation (H+  a  Na+),
nantiport látka/H+ nebo
nantiport látka/látka.
nUplatňují se při transportu:
ncukrů, metabolitů, anionů a léčiv.
nSkládají se ze 12- až 14- transmembránových segmentů
nobvykle fungují jako jednosložkové pumpy např. NorA St.aureus .
nU některých gramnegativních bakterií fungují spolu s MFP) a OMP a jsou tedy vícesložkové, např.
E.coli –EmrAB – TolC

ATP – binding casette (ABC) superfamily
nTento systém lze zahrnout do:
nkategorie sníženého příjmu látek,
nkategorie aktivního vylučování – efluxu.
n Systém využívá energie vznikající hydrolýzou ATP.
n Funguje u cukrů, AK, iontů, léčiv, polysacharidů a proteinů.
n Transportní proteiny z této skupiny jsou multiproteinové komplexy tvořené:
nintegrálními membránovými proteiny – fungují v rámci transportních pórů v cytoplazmatické membráně
ncytoplazmatickými proteiny s ATPázovou aktivitou.
nvětšinou tvoří dimery – dvě ATPázové podjednotky spojené s permeázami na straně cytoplazmy vnitřní
membrány
nTento systém je poměrně raritní u bakterií (popsán např. u  Lactococcus lactis) , ale u prokaryot
je známo asi 20 takových systémů.

Small multidrug resistence (SMR) family
n Transportéry z této skupiny se skládají:
nz přibližně 110 AK zbytků a
n4 transmembránových segmentů.
n Podílejí se na efluxu barviv, léčiv a kationtů.
n S ohledem na malou velikost se dříve předpokládalo, že fungují jako trimery,
n později bylo objasněno, že aktivní jsou ve formě tetramerů.
n Některé z těchto systémů byly popsány u St.aureus  (Smr pumpa) a  E.coli (EmrE pumpa),
n
n

Resistence-nodulation-cell division (RND) superfamily
n Původně se vědci domnívali:
n že existuje jen u eubakterií,
n nyní byl popsán i eukaryot a archeí.
n Eflux funguje jako antiport substrát /H+.
n většinou kódovány chromozomálně (intrinsic)
n v současnosti byly nalezeny i plazmidově (získaná R) kódované typy.
n RND pumpy se uplatňují u gramnegativních mikroorganizmů jako „multidrug transporters“ .
n Systém popsán:
nu kmenů mykobakterií ;
nu kmenů Pseudomonas aeruginosa eflux antibiotik, těžkých kovů, barviv, detergentů, rozpouštědel a
dalších látek.
nV posledních letech byly objeveny a  prozkoumány složky RND systému => NEXT SLIDES:
n

Složky RND systému :

nv roce 2000
nproteiny kanálu vnější membrány (outer membrane channel proteins)
nTrimer tvořeý dvěmi strukturami podobajícími se barelům, kotví tunelovitou strukturu uzpůsobenou
pro transport
nv roce 2002
nRND transportéry vnitřní membrány (inner membrane RND transporters)
nTyto komponenty jsou zodpovědné za rozpoznání molekuly, kterou je třeba efluxem vyloučit.
ndvě velké periplazmaticky umístěné kličky (loops) – cca 300 AK, které jsou schopny interagovat se
substrátem a rozpoznat jej.
nv roce 2004
nPeriplazmatické MF proteiny (periplasmic MFP)
nkruhovité struktury interagující:
ns proteiny kanálu vnější membrány + s RND transportéry.
nJsou nepostradatelné  pro kompletaci i pro funkci efluxního transportu
n

Multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family
nPřed časem řazen k MFS skupině, ale nyní vyčleněny pro strukturání odlišnost od MFS transport
syst.
nTyto proteiny jsou tvořeny:
nzbytky přibližně 450 aminokyselin
n12 transmembránových segmentů.
nProteiny patřící do této skupiny využívají Na+ gradient jako zdroj energie k efluxu kationických
barviv a chinolonů.
nPříkladem proteinů z této skupiny může být NorM u Vibrio parahaemolyticus a jeho obdoba u E.coli
protein YdhE.
n
nTzv. vícelékové efluxní proteiny (multidrug eflux proteins),
nspecifické exportní proteiny kódované plazmidy nebo chromozomálně.
npumpují tetracykliny, fluorochinolony, chloramfenikol, erytromycin, β-laktámy , z jiných například
dezinfekčních látek jsou tyto mechanizmy známé u kvarterních amoniových solí.
n

„Léky“ na tyto mechanizmy R
nVědci se tak jako u předchozích mechanizmů rezistence i zde snaží nalézt způsoby jak systémy
vyblokovat.
nV minulých letech byla pozornost soustředěna na látky patřící mezi tzv. Eflux Pump Inhibitors
(EPI) .
npříklad EPI – první širokospektrý inhibitor RND pumpy – potenciace účinku levofloxacinu
(chinolon), popsány rovněž další nové systémy inhibice – viz :.
nDalší napomáhají vyblokovat eflux tetracyklinů. Některé látky tohoto charakteru lze izolovat ze
samotných bakterií.
nPotenciální nebezpečí EPI látek se ale může skrývat v jejich toxicitě pro transportní systémy
eukaryot.
nBypassing Eflux Pump  jako alternativa k EPI. Zde je nebezpečí, že po čase toto překonání efluxu
naindukuje nový způsob R u bakterie.
n

nENZYMY
n
-Modifikující
-Inaktivující

Produkce modifikujících či inaktivačních enzymů
nPrincip je u všech skupin stejný :
nmodifikovat molekulu antibiotika takovým způsobem, aby přestala být účinná a nebezpečná pro
bakteriální buňku,
nmodifikace vede často až k úplné inaktivaci antibiotika.
n

Produkce modifikujících či inaktivačních enzymů
nEnzymy hydrolýzy
n
nΒ-laktamázy
nzákladní rozdělení na dvě základní molekulárně-strategické skupiny :
njedna je zaměřena na Serin – aktivní centrum (Ser-β-laktamázy)
ndruhá na Zn 2+ centrum (metalo-β-laktamázy)
nEsterázy makrolidů
npřítomnost genů nesoucích informaci o esteráze a tutíž R na makrolidy je nesena na mobilním
genetickém elementu, což umožňuje její přenos v bakteriální populaci
nmechanizmus je zásah do esterové vazby uvnitř cyklické molekuly makrolidu, reverzní
kruh-otevírající zásah esterázy … likvidace cyklického uspořádání molekuly makrolidu
nEpoxidázy
núčinek na fysfomycin, destrukcí reaktivního epoxidu otevřením kruhové struktury fosfomycinu
n
n
n

Produkce modifikujících či inaktivačních enzymů
nTransfery skupin
nSkupina modifikujících enzymů s velkou rozmanitostí. Tyto enzymy kovalentně modifikují
antibiotika, což má za následek alteraci struktury ATB, která ovlivní vazbu na cílovou strukturu
bakterie.
nAcetyltransferázy
nO-acetylace, N-acetylace,
npopsány u aminoglykosidů, chloramfenikolu, streptograminů
nFosfotransferázy
npatří mezi kinázy
nkatalyzují přenbos fosfátu, typicky z ATP
naminoglykosidové fosfotransferázy
npopsány i u některých makrolidů (erytromycin) a u některých peptidových antibiotik (viomycin) a
rifampicinu
nThioltransferázy
nthiolát glutationu se účastní otevření kruhu fosfomycinu ( viz výše zmíněno u epoxidáz)

Produkce modifikujících či inaktivačních enzymů
nTransfery skupin – pokračování
n
nNukleotidyltransferázy
npopsány dvě hlavní skupiny nukleotidyltransferáz:
nANTs – modifikují aminoglykosidy
nLin – modifikují linkosamidy (linkomycin, klindamycin)
nANTs jsou sice malo skupinou, co do strukturální rozmanitosti, ale mají velký klinický význam,
takto lze vyblokovat např. účinek gentamicinu nebo tobramycinu – gen je zastoupen v bakteriálních
populacích a jeho aktivace probíhá při používání atb z dané farmakologické skupiny
nADP-ribosyltransferázy
nmodifikační mechanizmus známý u prokaryot i eukaryot
ntento mechanizmus popsán např. u mykobakterií a R na rifampicin
nGlykosiltransferázy
nglykozilace makrolidů a rifampicinu, není příliš rozšířen,ale může nabýt na významu je-li např. u
nokardiové infekce takto podmíněná R
n
n

Produkce modifikujících či inaktivačních enzymů
nJiné enzymatické systémy rezistence
nRedoxní enzymy
nJedná se o oxidační nebo redukční mechanizmy – nepříliš rozšířené mezi bakteriemi.
nStreptomyces virginiae producent streptograminového antibiotika virginiamycinu (dříve používán ve
veterinární medicíně jako stimulátor růstu). Tato bakterie se chrání proti „selfkillingu“
mechanizmem redukce ketonové skupiny, takže vzniká antibioticky inaktivní sloučenina
nLyázy
nenzymy způsobující štěpení vazeb C-C nebo C-O nebo C-N nebo C- S. Způsob štěpení není ani
hydrolýza ani oxidace. Tento mechanizmus vede často k vytvoření dvojitých vazeb nebo uzavření
kruhu.Popsáno u streptograminu B.
n

Mechanizmy rezistence
u jednotlivých skupin antibiotik
Nejrecentnější seřazení a výčet viz publikace Duijkeren, 2018, případně Pokludová 2020

Tetracykliny (streptokoky, stafylokoky)
naktivní buněčný eflux (efluxová pumpa v cytoplazmatické membráně)
nvyloučení atb z buňky dříve než zasáhne cílové místo, geny podmiňující eflux jsou neseny
transpozóny
njako ochrana proti efluxu u tetracyklinů – nová forma modifikace na glycylcykliny
nnedostupnost cílových ribozómů
nv důsledku zablokování bílkovinami kódovanými tet geny – tyto geny jsou umístěny na transpozónu
chromozómu nebo také na plazmidech, přenos je možný konjugací
nalterace molekuly
nrezistence způsobená acetylací nebo fosforylací ribozómové bílkoviny nebo r RNA
ntet determinanty
nbyl dokázán i přenos mezi nepříbuznými taxony:
nMycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae, streptomycety
nu proteů chromozomální rezistence
nplazmidová rezistence u Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans
nPasteurella multocida  nese geny tet rezistence z G+ a G- bakterií
n

Chinolony
n existuje trojí mechanizmus rezistence (pokud dojde ke kombinaci mechanizmů, kmeny mají často
hodnoty MIC 128 – 1000 mg/l)
nmodifikace gyrázy (bakteriální topoizomeráza II) –
nmutací genu gyrA nebo gyrB, takto modifikovaná gyráza navozuje rezistenci ke všem chinolonům
n
nmodifikace porin determinujícího genu OmpF mutací, vede ke snížené nebo zcela vymizelé schopnosti
akumulace chinolonů
n
núnik a eflux chinolonů z buňky – stafylokoky, proteus
n
njelikož chinolony neexistují v přírodě, neměly analoga mezi mikrobiálně biosyntetizovanými
produkty  před jejich vývojem a zavedením do humánní a veterinární medicíny.
nJednotlivé mutace v „chinolony determinujících oblastech“ bakteriálního genomu umožňují zvýšené
přežití, následující „hot spot“ mutace vyvolávají vždy vyšší stupeň rezistence
nVznik rezistence k chinolonům byl u všech druhů bakterií zjištěn brzy po zavedení těchto sloučenin
do klinického užívání již více než před 10 lety a rozvíjí se velmi rychle.
n
n

makrolidy, linkosamidy a streptograminy
n
n
nidentifikovány tři metylázy (geny ermA,ermB – neseny na transpozónech a ermC nesen na malém
plazmidu) - způsobují ribozomální modifikaci
n
nnejčastěji byl identifikován gen ermC u kmenů stafyloků izolátů z humánního i veterinárního
materiálu (Werckenthin et al., 1997)
n
nu streptograminů popsány také jiné přenosné mechanizmy jako inaktivační enzym streptogramin-A
acetyltransferáza (sat-gen) a streptogramin-B hydroláza (vgb-gen) – popsány u stafyloků a
enterokoků (Zervos, 1997)
n
n

Aminoglykosidy
nPopsána kombinace mechanizmů :
n1.      snížená permeabilita
nzměna bílkoviny zevní membrány, alterace aktivního transportního systému
n
n2.      alterace cílové struktury
nsnížená vazba na 30 S ribozóm
n
n3.      alterace molekuly aminoglykosidu
nmodifikace (změna)
n- acetylací aminoskupin aminoglykosidu (=AMG)
n- fosforylace hydroxylových skupin molekuly AMG
n- nukleotidylace hydroxylové skupiny AMG
nmodifikace jsou způsobeny modifikujícícmi enzymy, které bakterie produkuje
n

Aminoglykosidy – alterace molekuly -modifikace
nAcetylace
nAAC (2´) enzym acetyláza – determinace geny na chromozómech
n(Providentia spp., Serratia marcescens, Enterococcus faecium, Acinetobacter haemolyticus)
nAAC (6´) I acetyluje a způsobuje rezistenci k AMI ne ke GEN determinanty na plazmidech
(determinanta je schopna inzerce do plazmidů a transpozónů nesoucích rezistence i na jiná
antibiotika)
nAAC (6´) II acetyluje a způsobuje rezistenci ke GEN ne k AMI , tento enzym je přítomen u kmenů
pseudomonád a také až u 50 % kmenů enterobakterií
nAdenylace
nANT (2´) I   aminoglykosid nukleotid transferáza – u pseudomonád, enterobakterií
nANT (4´)     méně častá
nFosforylace
nAPH (3´) rezistence ke KAN, NEO   ….. Nejméně 7 enzymů s označením APH (3´) I až VII
nAPH (3´) I   pseudomonády, G- fermentující tyčky
nAPH (3´) VI acinetobacter, aktivní ke všem aminoglykosidům
nZvláštní postavení má bifunkční enzym
nAPH (2´) + AAC (6´)
nurčuje rezistenci vysokého stupně ke gentamicinu u Enterococcus faecalis
nu stafylokoků je rezistence k aminoglykosidům u 40 % kmenů jen tímto bifunkčním enzymem
n
n
n

b- laktámy
n
nmechanizmy založené na PBP (viz výše) => tento typ má MRSA
nmechanizmy štěpení těchto antibiotik enzymy - b-laktamázami
n
nb-laktamázy
nprodukované G+ i G- tyčkami, koky, anaeroby i mykobakterii
ngenetické determinanty uloženy na chromozómech i na plazmidech
n
ninhibitory b-laktamáz mají zanedbatelnou hydrolytickou schopnost,
nale váží se na aktivní centrum a inhibují tak hydrolytickou aktivitu enzymu b-laktamázy (příklady
kyselina klavulanová, sulbaktám, tazobaktám), tyto inhibitory se používají v kombinaci s
b-laktámovými ATB – amoxycilinem, ampicilinem, ticarcilinem, piperacilinem, nově také s
cefoperazonem)
n

Klasifikace b-laktamáz
EXISTUJE NĚKOLIK KLASIFIKAČNÍCH SYSTÉMŮ !!!
Klasifikace dle:
-Hydrolytického spektra
-Citlivosti k inhibitorům beta-laktamáz
(dle Bushové, Jacobyho a Medeirose)
-Dle genetické charakteristiky a příbuznosti

-Dle toho, zda jsou neseny plasmidy či chromozomy

Klasifikace dle Bushové- Jacobyho a Medeirose skupina 1
ncefalosporinázy, které nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou
n
-Většinou kódovány chromozomálně
-Vybrané z nich odpovídají třídě B dle Amblera
-Hlavní producenti jsou enterobakterie a Pseudomonas aeruginosa
n
-

Klasifikace dle Bushové- Jacobyho a Medeirose skupina 2
npenicilinázy a / nebo cefalosporinázy, které jsou inhibovány kyselinou klavulanovou
n
-Obvykle plasmidy kódované enzymy
-Členění do podskupin dle preferovaného substrátu
-Do této třídy bývají řazeny i širokospektré betalaktamázy (ESBL) – třídy A
-

Klasifikace dle Bushové- Jacobyho a Medeirose skupina 3
nJsou závislé na zinku (proto metalobetalaktamázy) a nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou
n
n- Nazývají se také metalobetalaktamázy (MBL), molekulární třídy B
n- Hydrolyzují široké spektrum beta-laktamů, včetně karbapenemů, s výjimkou aztreonamu

Klasifikace dle Amblera (tř.A a B)
nTřída A
-Kódovány plasmidy, s výjimkou genů Klebsiella spp., Proteus vulgaris, Bacteroides spp.
-TEM- 1 a SHV-1 enterobakterií
-Jejich mutací vznikly AmpA betalaktamázy širokého spektra (řadící se mezi ESBL)
nTřída B
úDestruuje karbapenemy
úIMI, VIM, SPM a další karabapenemázy
úProducteme je např. Stenotrophomonas maltophilia

Klasifikace dle Amblera (tř.C a D)
nTřída C
§Chromozomální beta-laktamázy typu AmpC, s inducibilním nebo konstitutivním charakterem
§Producenti: Enterobacter spp., Citrobacter spp., Morganella morganii, Serratia spp. a Pseudomonas
aeruginosa
nTřída D
§Hydrolyzuje vysoce především oxacilin
§OXA betalaktamázy
§Producenti Aeromonas  spp. a nefermentující tyče

Epidemiologicky velký význam
nESBL ( = Extended Spectrum Beta-Lactamases)
nnejčastěji popsány u E. coli a Klebsiella pneumoniae, ale i u mnoha dalších G- baktérií.
nVětšina ESBL jsou deriváty enzymů TEM a SHV.
nRezistence vzniká na peniciliny, cefalosporiny 1., 2. a 3. generace, a aztreonam (monobaktam).
ESBL hydrolyzují tyto antibiotika.
nVybrané ESBL mohou být inhibovány inhibitory β-laktamáz.
nAmpC
nchromozomální β-laktamázy,
nÚčinek proti  cefalosporinům třetí generace (ceftriaxon, cefotaxim) a nejsou inhibovány kyselinou
klavulanovou.
ntřída C a do funkční skupiny 1 (Ambler)
nESCAPPM (Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter freundii, Acinetobacter spp., Proteus
vulgaris, Providencia spp., Morganella morganii.) Použití cefalosporinů třetí generace k léčbě
těchto infekcí vede k selekci mutantů, které hyperprodukují AmpC – velký problém u nozokomiálních
(nemocničních infekcí).

AmpC - pokračování
nindukovatelné enzymy primárně lokalizované na chromozómu
n
npreferenčně aktivní k cefalosporinům
n
ngen AmpC lokalizovaný na chromozómu kóduje enzym indukovatelný cefoxitinem, imipenemem a
aztreonamem
n
nexistují však také konstitutivní mutanty, které produkují enzym beta-laktamázu bez přítomnosti ATB
induktoru
n
nenzym typu AmpC I  byl zjištěn v kódování FOX-1 na plazmidu u  Klebsiella pneumoniae
n
nAmpC derivované enzymy BIL-1, FEC-1, MEN-1 nehydrolyzují cefamyciny
n

ESBL betalaktamázy
nTEM - primárně aktivní = destruující peniciliny i cefalosporiny
n
nv jedné je i TEM–1 plazmidová b-laktamáza G- tyček (tato b-laktamáza byla poprvé izolována v Řecku
a název – zkratka byla vytvořena ze jména pacientky (Temoniera) od níž byl izolován kmen E.coli
nTEM-2 a SHV-1  peniciliny a cefalosporiny, ALE jsou citlivé k inhibitorůmb-laktamáz
n
nESBL b-laktamázy (extended spectrum …)
njsou odvozené z dosud známých b-laktamáz, od kterých se liší většinou nepatrnou substitucí
aminokyselin v molekule a rozšířeným spektrem účinku
n
ncharakteristická je aktivita vůči ceftazidimu, cefotaximu a aztreonamu
n
nbylo popsáno již asi 40 enzymů derivovaných od TEM-1, TEM-2 a TEM-13 a více než 15 s TEM
nepříbuzných
n
nSHV deriváty označované jako CAZ-4 a CAZ-5 s vyšší afinitou k cefotaximu než ceftazidimu
n

Klasifikace b-laktamáz
nb-laktamázy s úplně rozšířeným spektrem účinku
nnejsou derivovány z TEM a SHV enzymů
njedním z nich je MIR-1, na které je zajímavé především to, že není vnímavá k inhibitorům
b-laktamáz (spektrum účinku cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, ceftibufen, aztreonam, cefoxitin,
cefmetazol, cefotetan, moxalactam)
nnepojmenovaný enzym (dle plazmidu s původním pracovním označením pMS350) izolovaná z kmenů
Pseudomonas aeruginosa (hydrolyzuje imipenem, ceftazidim, cefotaxim, cefoxitin, cefmetazol,
cefotetan, moxalactam a peniciliny), nehydrolyzuje piperacilin a aztreonam
n
nInducibilní  b-laktamázy Stenotrophomonas maltophilia L1 a L2
nL1 - metaloenzym - především penicilinázová a karbapenemová aktivita
n - nehydrolyzuje aztreonam
n - není citlivý k inhibitorům b-laktamáz
nL2 - v aktivním místě AK serin - štěpí cefalosporiny a aztreonam   - je ovlivnitelný inhibitory
(k. klavulanovou)
n
n

Přenos b-laktamáz
nPlazmidový, původně se šířily pouze mezi enterobakteriemi, později na Pseudomonas aeruginosa a
další nefermentující G – tyčky
n
nbyl také prokázán přenos na Haemophilus influenzae a Neisseria gonorrhoeae – zde se ale plazmidy
nereplikují.
n
nProkázán přenos také mezi stafylokoky a enterokoky.
n
n

Rozšíření specifity
n
nJe zajímavé, že k rozšíření specifity stačí často náhrada jedné AK v řetězci :
n
nPříklady:
nTEM-1 náhrada argininu za serin na pozici 164 má za následek rozšíření specifity na aztreonam a
ceftazidim a tento enzym má již také jinou klasifikaci – TEM-12
n
nDalší zajímavostí je, že někdy může být stejná specifita ve dvou variantách obsazení AK v řetězci
:
nlyzin 104 a serin 164  TEM-26
nlyzin 240 a serin 164 TEM-10
n