Laboratorní kontrola antimikrobní terapie Diluční metody Update 2023 L.Pokludová MU_CZ Diluční metody Agarová diluční metoda -Na Petriho miskách, agarové médium, antibiotikum v agaru -Sada P.M. s dvojnásobně (geometricky) se zvyšující konc. -Zde na obrázku miska vlevo nižší konc., proto narostlo více izolátů, vpravo miska s vyšší konc, některé izoláty již inhibovány -Inokulum se nanáší bodově (mikromnožství) -Body mají čísla (= č izolátů), hodnotí se nárůst, první miska, kde bod chybí (izolát nenarostl) je MIC - Diluční bujónová metoda („makrometoda“- zkumavky) -Sada zkumavek s dvojnásobně (geometricky) se zvyšující koncentrací, antibiotikum v bujónu -Inokulace standardizovaným inokulem s kulturou bakterií (v určitém poměru s celk objemem média ve zkumavce), -Hodnotí se zákal´(= nárůst) vs čirost -Třetí zkumavka, 8 µg/ml je MIC - Diluční mikrometoda (bujón , destičky) - Stejný princip jako „zkumavková metoda výše“, jen mikroobjemy, možnost větší automatizace inokulace i odečítání (readery) Diluční metody lDILUCE = ředění (na různé koncentrace) => „hledáme takto nejčastěji MIC“ l lCílem je prokázat stupeň rezistence (citlivosti) testovaných bakteriálních kmenů k antimikrobikům l lkvantitativní stanovení stupně citlivosti (rezistence) stanovení hladiny MIC (Minimální Inhibiční Concentrace) l lJsou vhodné i pro pomalu rostoucí bakterie a bakterie se speciálními nároky (včetně anaerobů) => Pro tyto druhy bakterií jsou vyvinuty modifikace metod, půd i kultivačních podmínek. Kvantitativní vyšetření citlivosti je metodou volby pro l lMikroorganismy s nízkou růstovou rychlostí, nebo se speciálními kultivačními nároky, jako jsou například: lanaeroby, legionely, kampylobaktery, korynebakteria, nokardie, pomalu rostoucí nefermentující tyčky, mykotické organismy a další ldiluční mikrometodu (v tekutém médiu) nelze použít pro mikroorganismy, které v tekutém prostředí autolyzují Význam použité metody : l1) Základní výsledky stanovení slouží jako : lpodklad pro výběr antimikrobních látek event. použitelné terapeutické koncentrace (toto je důležité zejména u izolátů z tělních tekutin za normálních podmínek sterilních - krev, likvor aj.) se zaměřením na cílenou léčbu onemocnění způsobenou zkoumaným infekčním agens. l l2) Rozšířené výsledky (včetně výsledků testování látek nepoužívaných v terapii) slouží jako podklad pro l * monitorování a přehledy rezistence, l * pro odlišení kmenů se sníženou citlivostí k lékům volby (u daného druhu bakterie a dané infekce) l * vyhledávání neobvyklé rezistence - HLA R enterokoky (HLAR) l - VAN R enterokoky (VRE) l l3) Speciální výsledky pro účely ltaxonomické lpro účely laboratorního ověřování nově registrovaných přípravků aj. Diluční metody l7.1.1 Agarová diluční metoda l l na Petriho miskách – pevné medium! l l7.1.2 Diluční mikrometoda l l v mikrodestičkách – tekuté médium! 7.1.1 Agarová diluční metoda l lPrincip metody lMIC se hodnotí na agarových půdách, které obsahují zvolené koncentrace antibiotik. lObvykle se připravuje 12-15 koncentrací jednoho antibiotika, ředěných dvojnásobně geometrickou řadou. lNa půdy se očkuje standardní inokulum vyšetřovaných bakterií. lNa jednu plotnu obsahující jednu koncentraci antibiotika se ručně naočkuje cca 20 kmenů a inokulátorem 32 – 45 kmenů. l l lMetoda lje vysoce standardizovaná, referenční, llze jí vyšetřit velké množství kmenů za stejných podmínek lje spolehlivá při hodnocení nových atb llze jí odhalit kontaminaci kmene i heterorezistentní populaci l graphic011 Agarová diluční metoda kultivační média lMueller - Hinton Agar (MHA) - komerčně vyráběné medium : l MHA bez obohacení vyhovuje pro testování citlivosti většiny kmenů. l Má obsahovat 20 - 25 mg Ca2+ a 10 - 12,5 mg Mg2+, skladování krátkodobé : 2-8 °C l lMueller Hinton Agar + 5 % defibrinované koňské krve + 20 mg/L β-NAD (MH-F) pneumokoky, listerie l hemofily,branhamely, kampylobakter, moraxela, pasteurella, korynebakteria … lBCYE ( pufr. agar s kvasnič. extr. a živočiš. uhlím) legionely l Buffered Charcoal Yeast Extract Agar supplemented with α-ketoglutarate (BCYE-α) l lWCA (Wilkins Chalgren Agar), BA (Brucela Agar) anaeroby l l l(MHA + 2 % NaCl dříve stafylokoky (OXA) ) Agarová diluční metoda postup přípravy ploten l1) Na předem označené P.M. se napipetuje příslušná koncentrace antimikrobika (celkový objem 2 ml). l l2) Následně do P.M. na misku o průměru 90 mm (výška agaru cca 4 mm = cca 25 ml vysterilizovaného média ochlazeného na max 45 °C. Miskou se krouživým pohybem rozvrství rovnoměrně agar bez bublin a ponechá se utuhnout na vodorovné ploše. l l3) Misky s bublinami vzduchu, nerovnoměrně ztuhlým agarem event. lnerovným povrchem se musí vyřadit. l l4) Skladovat lze při 4 °C zatavené do plastových fólií 7 dní, misky ls ampicilinem a cefaclorem 3 až max 5 dní, misky s imipenemem nebo amox/clav se musí spotřebovat v den přípravy. l l5) Před použitím nechat plotny vytemperovat a nejlépe i předsušit při l36 °C (nesmí obsahovat kondenzní vodu – kolonie by se „slily“) Agarová diluční metoda inokulum lK přípravě inokula o vyhovující koncentraci buněk se používá l lzákalový standard dle McFarlanda odpovídající koncentraci 5 x 104-5 buněk / ml. Hodnocení referenční suspenze a suspenze mikroorganismů pomocí zákalometru. l Agarová diluční metoda postup inokulace lObvykle se očkuje 1 – 2 μl a vytvoří se otisk o průměru max 5 mm l lInokulace : lmikropipetou, kalibrovanou kličkou nebo inokulátorem l lParalelní inokulace kontrolní plotny bez atb, ločkování od nejnižší koncentrace atb po nejvyšší l lPo naočkování nechat zaschnout inokulované kapky a pak teprve přemístit do termostatu l Agarová diluční metoda referenční mikroorganismy lReferenční mikroorganismy lKmeny se stabilními vlastnostmi a známou citlivostí k antibiotikům poskytované sbírkami typových kultur. lSlouží pro kontrolu přesnosti stanovení a kontrolu dodržování standardní hustoty inokula a standardního pracovního postupu. lS touto kontrolou je nutno pracovat nejlépe při každé sérii stanovení, zcela nezbytná je pak kontrola každé nové série misek. l lPoužívání referenčních kmenů lKmeny jsou distribuovány např. Českou sbírkou mikroorganismů v Brně ve formě želatinových disků na jedno použití . Tato forma uložení zajištˇuje stálost vlastností kmene a minimalizuje možnost kontaminace . Oživování kmenů ze želatinových disků odpovídá návodu z CCM . Kontrolní kmeny – želatinové disky Agarová diluční metoda inkubace ploten l lDo 15 minut po inokulaci se misky umístí do termostatu ve sloupci po maximálně l 5 miskách a inkubují se při teplotě do 35 °C l ldoba kultivace a použitá atmosféra – např. CO2 (dle specifikace mikroorganismu). Agarová diluční metoda -hodnocení lPo příslušné době inkubace se misky vyjmou z termostatu a umístí na tmavou podložku. (pokud není používáno automatického readeru a vyhodnocovače). l lZhodnotí se nárůst mikroorganismů na kontrolních miskách bez atb a posoudí se čistota kultur. l lOdečte se koncentrace, která zřetelně inhibuje růst. l lVelmi jemný povlak, který se vytváří v koncentracích vyšších než je koncentrace zřetelně inhibující růst se ignoruje. l lVyšetření se opakuje při podezření na kontaminaci inokula (jiný vzhled na P.M. s různými koncentracemi). Agarová diluční metoda - vyjadřování výsledků a interpretace lNejnižší koncentrace atb, která inhibuje růst je MIC. l lMIC zjištěná u testovaného kmene se porovnává s breakpointy citlivých kmenů. l lKmeny s MIC rovnou nebo nižší než breakpoint jsou označeny jako citlivé. l lU některých mikrobů a nebo při pochybnostech (např. u mikrobů produkujících ESBL beta-laktamázy je nutno provést doplňková vyšetření). Diluční metody v tekutém médiu lDiluční „zkumavková“ metoda l l l lDiluční mikrometoda 7.1.2 Diluční mikrometoda lJe používána ke kvantitativnímu stanovení aktivity antimikrobních látek vůči bakteriálním izolátům. l lStanovuje se MIC, tj. nejnižší koncentrace, která viditelně inhibuje růst testovaného mikroorganismu. l lSterilní plastová mikrodiluční destička obsahující v jednotlivých mikrojamkách v bujónu rozplněné postupně dvojnásobná ředění (geometrická řada) => sada koncentrací antibiotik (v rozsahu obsahujícím brakpointovou koncentraci) je inokulována standardizovanými suspenzemi testovaných bakterií. Inkubuje se 18 - 24 hod při 35 °C. Diluční mikrometoda kultivační média lMueller - Hinton broth (MHB): lkomerčně vyráběné medium dle ISO standardu 20776-1, 2019: l MHB bez obohacení vyhovuje pro testování citlivosti většiny kmenů. l Má obsahovat 20 - 25 mg Ca2+ a 10 - 12,5 mg Mg2+, skladování krátkodobé : 2-8 °C l lMueller Hinton Broth + 5% lyzátu koňské krve + 20 mg/L β-NAD lStreptococcus spp. (including S. pneumoniae), Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni a C.coli, Pasteurella multocida, Corynebacterium spp., Aerococcus sanguinicola a A. urinae, Kingella kingae l lBHI (Brain Heart Infusion), lAB (Wilkins Chalgren), BB (Brucela Broth) anaeroby l lDestička z každé připravené série se inkubuje při 35°C / 24 hodin pro kontrolu sterility (v odděleném termostatu). lZatavením destiček do sáčků nebo důkladným přebalem alobalem lze zamezit odparu vody a prodloužit dobu použitelnosti na 2 týdny po přípravě. lDestičky lze skladovat zamražené při teplotě -20°C až 6 - 8 týdnů a při -70 °C i déle. lRoztoky ampicilinu menší stabilita (max 4 týdny), Roztoky amox/clav a imipenemu nestabilní - nelze zmrazit. Diluční mikrometoda způsob inokulace l lInokulum o hustotě : l5 x 104-5 v jamce se 100μl tj. 5 x 105-6 buněk/ml lObvykle se očkuje 1 – 5 μl (max však 10 μl) na jamku lInokulace : lvícekanálovou mikropipetou např. z P.M. nebo lmultidávkovým replikátorem z dávkovače Diluční mikrometoda inkubace destiček l lNejpozději do 30 minut po inokulaci se destičky umístí do termostatu a inkubují se při teplotě do 3 °C l ldoba kultivace a použitá atmosféra – např. CO2 (dle specifikace mikroorganismu). Odečítání MIC mikrodiluční metoda (zdroj CDC, Lesley McGee) l lab-susceptibilityTest-lg Odečet MIC (zdroj foto EUCAST) Diluční mikrometoda - hodnocení lPo příslušné době inkubace se destičky umístí na tmavou podložku. (pokud není používáno automatického readeru a vyhodnocovače). l lZhodnotí se nárůst mikroorganismu v kontrolní jamce obsahují pouze živné médium bez atb a posoudí se zda je zákal difúzní nebo sedimentující. l lS pozitivní kontrolou růstu se porovnávají další jamky, které však již obsahují atb. Odečte se koncentrace, která zřetelně inhubuje růst. l lU trimetoprimu a sulfonamidů se odečítá jako negativní už koncentrace s velmi slabým zákalem (tam kde je růst inhibován cca z 80 %) l lJedna čirá jamka v řadě jamek se zřetelným nárůstem se ignoruje, nejedná-li se o jamku s nejvyšší koncentrací atb. Také dvě čiré jamky je možno ignorovat, pokud se po nich vyskytují alespoň dvě jamky se zřetelným nárůstem. Jiné odchylky by měly být zváženy a vyšetření by mělo být eventuelně zopakováno. Mírný zákal, nebo zákal bez vloček pozorovaný u izolátů pseudomonád nebo acinetobakterů musí být považován za nárůst a tak jako MIC lze odečíst až první čirou jamku bez viditelného zakalení(nárůstu). MIC jsou zakroužkovány červeně. Pro mikroorganizmy testované na médiu MH-F může být patrná hemolýza krevních komponent. Většinou je spojená se zákalem, nebo usazeninou (vločkami). Odečtěte jako MIC až jamky bez těchto efektů Čiré MHB médium - odečet MH-F médium – hemolýza - odečet Může dojít k situaci, kdy vybrané jamky jsou „vynechány“, tj. chybí v nich nárůst, což může být např. způsobeno ucpáním kanálu pipety a neinokulováním. Test je vhodné zopakovat, nebo v případě pouze individuální jamky odečíst následovně. MIC jsou zakroužkovány červeně. Retestovat nebo odečíst nejvyšší MIC Výsledky nejsou validní ! Odečítání G+ koků s bakteriostatickými ATM Neberte v úvahu téměř nepatrný nárůst (špendlíková hlavička/tečka). MIC jsou zakroužkovány červeně. Odečet při „vynechané“ jamce G- mikroorganizmy : tigecyklin a eravacyklin Neberte v úvahu téměř nepatrný nárůst (špendlíková hlavička/tečka). MIC jsou zakroužkovány červeně. Trimethoprim a kombinace Trimethoprim/sulfamethoxazol Odečti MIC nejnižší koncentrace, která inhibuje >80% nárůstu v porovnání s kontrolou nárůstu. MIC jsou zakroužkovány červeně. Kontrola nárůstu Pro interpretaci výsledků je zásadní: -Před hlášením výsledků klinických izolátů je nutné se ujistit, že hodnoty MIC pro kmeny používané v rámci kontroly kvality jsou v rámci akceptovatelných rozmezí (viz EUCAST QC kritéria). -Interpretovat MIC hodnoty dle současných kategorií: -S = susceptible => C = Citlivý -R = resistant => R = rezistentní -I = susceptible, increased exposure => I = citlivý, zvýšená expozice lPrezentace je určena výslovně pro účely výuky, l l l lPoužité fotografické materiály pocházejí lz citovaných zdrojů: lWeb stránky EUCAST lWeb stránky CCM l l lPrezentace není určena k dalšímu šíření. l