Eduard Kejnovský + Zdeněk Kubát + Roman Hobza EVOLUČNÍ GENOMIKA: V. DYNAMIKA GENOMŮ 2. část CHROMOSOMÁLNÍ DISTRIBUCE TRANSPOSONŮ Obsah obrázku pes, interiér, savci, opálení Popis byl vytvořen automaticky •- výskyt na všech chromozomech (hybridizace in situ) •- místa s vyšší koncentrací retroelementů i bez retroelementů •- retroelementy v heterochromatinu i euchromatinu, hřbitovy RE •- sex chromozomy - akumulace na chromozomu Y: • u D. miranda, Cannabis sativa, Marchantia polymorpha, Silene latifolia Chromozomální distribuce retroelementů S. latifolia X Y S. latifolia Marchantia polymorpha Y Selekce nebo cílené včleňování? Inzerční specificita a inzerce retroelementů do heterochromatinu - inzerce není náhodná (retroviry) - role INT – chromodomain/targeting domain (TD) - interakce s proteiny chromatinu - inženýrství (nové specifity), genová terapie - „local hopping“ DNA TE (Voytas lab) integráza heterochromatin Inzerce retroelementů do již existujících retroelementů Metoda „transposon display“ – detekce nových inzercí transposonů - indukce transpozice stresem - štěpení genomické DNA - ligace adaptorů - PCR okolní oblasti -nové bandy - - - -U osekvenovaných a poskládaných genomů se využívá sekvenace gDNA, na základě srovnání lze nalézt „neoinzerce“. Funkce transpozonů (v genomu) B A C Transposon Gen X Nefunkční protein Transkripce v jiném typu buněk Bez efektu Jaké jsou důsledky inzerční aktivity transpozonů? A B C Genetické choroby Rakovina Jak transpozony mění genom Inzerční mutageneze Chimerická mRNA Antisense RNA Rekombinační přestavby Umlčení způsobené metylací Bestor 2003, TIG Transposony a lidské nemoci - využití v diagnostice a terapii většina lidského genomu je transkribována hypometylace Alu/LINE elementů (TE+epigenetický kód) zvýšení „Aluomu/LINEomu“ nádorových buňkách inzerce do tumorsupresorových genů + rekombinační přestavby genomu stárnutí a rakovina - vazebné místo p53 je odvozené z TE Kejnovský Vesmír 2013/4 Obranné mechanizmy eukaryot Transcriptional gene silencing (TGS) Post-transcriptional gene silencing (PTGS) Transcriptional gene silencing (TGS) Regulace transpozonů u eukaryot Epigenetické mechanizmy small RNA Argonaut Epigenetické mechanismy = modifikují DNA a histony pomocí chemických značek. RNAi (RNA interference) = interakce mezi DNA, RNA a proteiny, kde jsou prostředníkem (jakousi signální molekulou) krátké molekuly RNA – tzv. small RNA. Small RNA je mnoho typů, liší se mechanismem vzniku a účinku, a také délkou Základní členění small RNA: miRNA = micro RNA, vznikají z tzv. miRNA genů, které se přepisují do RNA s vlásenkovou sekundární strukturou, regulují geny, ale mohou regulovat i TE. siRNA = short interfering RNA, vznikají především z TE (ale i z genů) – z mRNA nebo z lncRNA (long non-coding RNA), regulují především TE, ale i geny. Small RNA řídí mnoho vnitrobuněčných procesů pomocí: Posttranskripční umlčení (PTGS) = degradace mRNA na základě komplementarity Transkripční umlčení (TGS) = metylace DNA na základě komplementarity, metylace DNA je prvním krokem heterochromatinizace → následuje modifikace histonů, vazba chromatinových remodelerů atd. PTGS a TGS jsou vzájemně provázány a ovlivňují se prostřednictvím small RNA = produkty PTGS (rozštípané molekuly RNA) mohou řídit metylaci DNA. Small RNA jsou mobilní, mohou být posílány mezibuněčnými spoji nebo vodivými pletivy rostlin a ovlivňovat metabolismus v jiné části organismu. Byl například prokázán přenos small RNA z kořene do naroubované části rostliny, small RNA produkované v podpůrných buňkách chrání buňky zárodečné dráhy před TE u živočichů (piRNA = piwi-interacting RNAs) i rostlin, zajišťují „imunitu“ rostlin vůči virům… → Epigenetické regulace = široký pojem, který se používá pro širokou škálu dějů včetně takových, které svou podstatou neodpovídají definici epigenetiky, tedy zahrnuje i RNAi, jelikož RNAi v důsledku vede k epigenetickým modifikacím. de novo metylázy udržovací metylázy demetylázy Metylace DNA reverzibilní biologický signál Forschungsbericht_Epicombing_Zillner_figure1 Zapnuto Vypnuto Metylace DNA CG Symetrická metylace Rostliny Živočichové CG CHG CHH Asymetrická metylace X Obnova po každé replikaci de-novo RdDM (RNA-directed DNA methylation) Bakterie X A → Složitější epigenetické regulační mechanismy u rostlin H = A, T or C Metylace TE u živočichů a rostlin Živočichové (CG) CG CHG CHH TE TE TE TE TE ostrov TE ostrov Gen Gen Rostliny (CG, CHG, CHH) nový TE nový TE CG + CHG = udržovací metylace již zametylovaných oblastí CHH = de novo metylace hranic genů/TE, nových inzercí TE Somatické buňky Reprodukční buňky TE převážně umlčené, nízká transkripční aktivita Epigenetické reprogramování genomu → TE jsou aktivní Kdy a kde jsou transpozony aktivní ? Epigenetické reprogramování u savců piRNA piRNA cluster AAAA TE PGC, follicle cells, nurse cells Epigenetické reprogramování u savců Epigenetické reprogramování u rostlin Samičí gametogeneze Figure 3 | Epigenetic reprogramming during embryogenesis. Indirect evidence (represented as dashed lines) suggests that levels of DNA methylation are very low in the central cell and reduced in the egg cell. This is reflected in the early endosperm genome, which is characterized by reduced DNA methylation levels and active transcription of transposable elements (TEs). By contrast, CG methylation in the embryo is restored to the adult level by the globular embryo stage. CHH methylation in the zygote is expected to be reduced owing to the incorporation of the CHH-demethylated paternal genome. The recovery of CHH methylation in the embryo is completed by the heart-shaped embryo stage when the endosperm becomes cellularized. Obrázek z: Kawashima a Berger, 2014, doi:10.1038/nrg3685 Epigenetické reprogramování u rostlin Samčí gametogeneze Figure 2 | Epigenetic reprogramming during male gametogenesis. The level of CHH methylation decreases from the microspore stage until the sperm cell stage; however, the level of CG methylation remains stable, which is consistent with the expression of genes involved in DNA methylation. As it is not directly related to the level of DNA methylation, transcription of transposable elements (TEs) is prominent in the vegetative cell but not in sperm cells. In contrast to the sperm cells, the vegetative cell loses CG methylation and restores CHH methylation especially at long terminal repeat (LTR) retrotransposons. For the vegetative cell and sperm cells, the expression status of various enzymes involved in DNA methylation and demethylation is shown in the table. CMT2, CHROMOMETHYLASE 2; DDM1, DECREASED DNA METHYLATION 1; DME, DEMETER; DRM2, DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 2; MET1, DNA METHYLTRANSFERASE 1; RdDM, RNA-directed DNA methylation. Obrázek z: Kawashima a Berger, 2014, doi:10.1038/nrg3685 Epigenetically activated miRNAs (Creasey et al., 2014) tRNA derived siRNAs (Martínez et al., 2017) Rostliny: Podpůrné buňky gamet zdroj regulačních sRNA TRANSPOSONY UŽITEČNÉ PRO HOSTITELE? DOMESTIKACE TRANSPOSONŮ Vliv TE na fenotyp Nature 2006 Tanaka 2008, Plant J Xiao 2008, Science Nature 1980 Nature 1980 Transpozony – parazité nebo pomocníci? Negativní vliv transposonů na hostitele - vyplývá z povahy RE (sobecká a parazitická DNA) - choroby - mutabilita – stochastické „mutageny“ Obranné mechanizmy hostitele - Metylace DNA - RNA interference Barva hroznů vína je způsobena transposony - Gret1 retrotransposon v promotoru genu VvmybA1 (inzerce a excize) This et al 2007, TAG Barva myší a epigenetický stav transposonů Slotkin 2007, NatRevGenet - IAP transposon v promotoru -> exprese Agouti -> žlutá myš - metylace IAP -> žádná exprese -> hnědá myš - mezistavy (epigenetický stav, PEV) Whitelaw and Martin 2001, NatureGenet Bhattacharyya et al 1990, Cell Zvrásnění semen hrachu jsou způsobeno transposony r (rugosus) lokus: rr – zvrásněné semeno RR, Rr – kulaté semeno - Ac/Ds DNA transposon Huang et al 2010, Cell Transposony stojí v pozadí variability lidské populace ATC CTAGT HEL RPA 16-20b ~11b Journey of Helitrons (non-autonomous) through maize genome and capturing genes: Helitrony putují po genomu a sbírají geny Mnohonásobný vznik transkripčních faktorů začleněním transpozázy u obratlovců – vznik regulačních sítí Cosby et al., 2021 Cosby et al., 2021 Mnohonásobný vznik transkripčních faktorů začleněním transpozázy u obratlovců – vznik regulačních sítí Domestikace transpozáz Všechny nástroje přirozeného genetického inženýrství jsou získány od Transpozonů. Na počátku embryonálního vývoje před nástupem vlastní inaktivace musí buňka zjistit, jaký je její poměr A:X, pokud 1, je potřeba zvolit, který chromosom bude inaktivován. Počítání i inaktivace je řízena oblastí Xic (X-inactivation centre), které obsahuje řadu regulačních elementů včetně Xist. Jakmile je rozhodnuto o tom, který X bude inaktivován, začne se na tomto chromosomu transkribovat dlouhá nekódující Xist RNA, která se rozprostře po celém chromosomu a umlčí ho. Pokud je Xist přenesen na autosom, provede jeho umlčení, ale to je méně efektivní. Xist tedy nepotřebuje žádné sekvence, které by byly jen na X. Ukazuje se, že cílovými sekvencemi Xist jsou mobilní elementy LINEs, které se na X vyskytují hojněji než na autosomech. Pokusy s buňkami s tranlokací t(X;4) ukázaly, že inaktivace se zastavuje na hranicích X a 4 a koreluje s prudkým poklesem koncentrace LINEs. Rozprostření Xist RNA je následováno odloučením RNA polymerázy II od chromosomu, ztrátou euchromatinových epigenetických značek, provedením represivních epigenetických modifikací (metylace H3, hypoacetylace H4 a metylace DNA). Inaktivované X vytvoří Barrovo tělísko poblíž jaderné membrány, replikuje se později než zbytek genomu a až na několik segmentů není exprimováno. Jak vzniká kompenzace dávky genů na neo-X drosofily? Neo-X chromozom u Drosophila miranda starý 1,5 milionu let právě prochází evolucí kompenzace dávky genů. 1)Helitron ISX nese funkční ale neoptimální motiv, který je rozpoznáván MSL. 2)Helitron ISX (mobilní element) se včleňuje na různá místa chromozomu neo-X. 3)V jednom z inzertovaných ISX došlo k výhodné mutaci – vznikl optimální motiv pro vazbu MSL. 4)Nealelická genová konverze nyní homogenizuje jednotlivé inzerce ISX a přenáší tak výhodnou mutaci na další ISX včleněné do neo-X. 5)Selekce upřednostňuje jedince s co největším počtem těchto výhodných mutací. 6) MSL = male specific lethal complex. Rozpoznává GC bohatý motiv na X a řídí zdvojnásobení transkripce X genů u samců. Retrogen způsobil krátkonohost u psů - chondrodysplasie (krátkonohost) DNA mRNA gen fgf4 retrogen fgf4 hnRNA LINE Science 325, 995 (2009) jediná evoluční událost změna fenotypu •Lidský genom obsahuje ~ 8000 retrokopií genů (Navarro, Galante, GBE, 2015) • •Segmentální duplikace zodpovídají za více než 90 % genetické variability mezi lidskými populacemi (Sudmant et al., Science, 2015) Aktivace transposonů stresem je běžná u rostlin Sucho, UV záření, poškození, kultivace in vitro, … 2 hypotézy proč stres aktivuje TEs (oslabený hostitel x variabilita a adaptace) TE + epigenetický kód Stres aktivace TE rozkolísání genomu adaptace stres aktivace TEs dlouhodobá odezva aktivace obranných genů krátkodobá odezva TE zajišťují dlouhodobou odezvu na stresové podmínky formou změn epigenetické regulace nebo genetické informace. Explosivní amplifikace transposonů a speciace 3x více BARE TE na jižním svahu (ječmen) Evoluční kaňon (Israel): vačnatci placentálové Mezidruhová hybridizace aktivuje TEs - „destrukce“ silencingu Kim et al., 2004 Explozivní amplifikace transpozonů doprovází velké evoluční události (speciaci) Teorie přerušovaných rovnováh (N. Eldredge, S. J. Gould) Zamrzlá evoluce – střídání plastických a „zamrzlých“ fází (J. Flegr) Endogenní retroviry Transpozony – parazité nebo pomocníci? Transpozony mohou být „domestikovány“ - telomeráza - telomery drozofily – Het-A, TART - centromery – CENP-B z DNA transposonů - imunitní systém – V(D)J rekombinace - syncytin v placentě (retrovirální env) Transpozony „přebudovávají“ genom - přestavby genomu, rekombinace - duplikace, rodiny, vznik nových genů (Setmar) - role v segregaci chromosomů, izolace, speciace - reparace zlomů v DNA - inaktivace chromosomu X - tvorba nových regulačních sítí Transpozony jsou extrémně důležitou evoluční silou! parazité x významný činitel v evoluci? Negativní vliv transposonů na hostitele - vyplývá z povahy RE (sobecká a parazitická DNA) - choroby - mutabilita – stochastické „mutageny“ Obranné mechanizmy hostitele - Metylace DNA - RNA interference Mechanizmy transposonu minimalizující jejich vliv na hostitele - včleňování do heterochromatinu - odstraňování elementů rekombinací V průběhu evoluce dochází ke koadaptaci transposonů a hostitele Proč trpí eukaryota transpozony ve svých genomech? Nekonvenční: Epigenet. mech. vznikly z obranných systémů prokaryot pro regulaci homologní rekombinace (umlčená DNA je inertní vůči rekombinaci), kvůli snížení HGT. Teprve poté byly exaptovány pro umlčení TE. Epigenet. mech. se staly předpokladem množení transpozonů v genomech. Epigenetika + transpozony zvýšily evoluční potenciál organizmů a mohly vzniknout složité mnohobuněčné životní formy. Konvenční výklad: 1)Nejprve byly genomy osídleny transpozony. 2)Epigenetické mechanizmy se vyvinuly na obranu proti transpozonům. (Francis Crick – parazitické sekvence) Prokaryota: - malé genomy efektivně využité operony - malé množství transpozonů - Obranné mechanizmy založené na rozlišení vlastní od cizorodé DNA (ta je degradována) - Homologní rekombinace neumožňuje duplikace genomu Eukaryota: - velké genomy plné repeticí - obrovské počty transpozonů - složité epigenetické regulační mechanizmy cílící na umlčení cizorodé DNA - Všudypřítomnost duplikované DNA vs. (Nina Fedoroff, 2012, Science 338:758-767) „Bez transposonů bychom zde nebyli a živý svět by pravděpodobně vypadal velmi odlišně.“ Susan Wessler „Retrotransposony nemohou být zcela sobecké, protože hostitelský genom i vědci je využívají ke svému vlastnímu prospěchu.“ :-) Jeffrey Bennetzen Kejnovský Vesmír 2009/9 Role mobilních elementů v evoluci buněčných organizmů (Závody ve zbrojení) Mobilní elementy u bakterií v širším slova smyslu Restrikčně modifikační obranné systémy prokaryot (R-M system) Koexprese Restrikční endonukleázy a Metyltransferázy ve společném operonu (obdoba Toxin-antitoxin modulů) REase -> štěpení nemodifikované gDNA MTase -> metylace DNA MTase je méně stabilní než REase -> degradace gDNA po ztrátě operonu Rozlišení vlastní a cizorodé DNA! R-M systémy se šíří HGT, vektorem bývají plazmidy, obvykle následuje trvalé začlenění do gDNA R-M systémy fungují jako obranný mechanismus proti cizorodé DNA (plazmidy, viry, transpozony,…), ale zároveň jsou sobecké, protože vytváří závislost hostitele na sobě samých. Postsegregational cell killing. Plasmid-harbored R-M gene complexes tend to propagate as selfish genetic elements to promote their own survival. The R-M system present in a cell expresses both REase and MTase: the REase restricts the foreign DNA, and the MTase protects the host genome against cleavage by the cognate REase. The postsegregational loss of the R-M gene complex results in the loss of methylation. The REase, owing to its higher level of stability, attacks the unmodified host genome, resulting in cell death (see “Selfish Genes”). The R-M gene complex thus propagates in the clonal population, resulting in the addiction of the host cell. CRISPR/Cas systémy – mnoho variant Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Domestikace caspozázy -> adaptační modul CRISPR/Cas Mnoho fágů a transpozonů nese CRISPR modul nebo celý CRISPR/Cas se sekvencemi jiných virů (=obrana vlastního hostitele). CRISPR-Cas adaptive immunity. The three stages of CRISPR-Cas system function are schematically illustrated. During CRISPR adaptation, the injection of phage DNA into bacterial cell (illustrated at the upper left) activates the Cas1–Cas2 adaptation module proteins which excise spacer-sized fragments of phage DNA and channels then for incorporation into CRISPR array. During CRISPR RNA biogenesis, CRISPR array is transcribed and resulting pre-crRNA is processed at repeat sequences to generated crRNAs. Individual crRNAs are bound by Cas protein effectors. When phage DNA with sequences matching a CRISPR spacer appears in the cell (lower right), effectors programmed by appropriate crRNA bind to it and the resulting R-loop complex is destroyed by Cas executor nuclease Obranné systémy jsou potenciálně škodlivé (autoimunita) a v nepřítomnosti parazitů je selekce odstraní. Obranné systémy se proto šíří prostřednictvím HGT (plazmidy, fágy,…) = ME ve funkci obranných systémů. Mobilní elementy používají komponenty obranných systémů jako zbraně proti hostiteli nebo jiným parazitům (vytvoření závislosti). Ke vzniku nových obranných systémů jsou často využity komponenty ME. = koevoluce ME a obranných mechanizmů, opakované exaptace komponentů (nájemní zabijáci). Obranné systémy jsou mobilní R-M systémy mohou zapříčinit vznik nových bakteriálních kmenů Většina bakterií obsahuje jednotky až několik desítek různých R-M systémů najednou. Ziskem nového R-M systému bakterie pozbývá schopnost „komunikovat“ pomocí HGT s ostatními bakteriemi svého kmene (kvůli absenci specifických modifikací gDNA degraduje transferovanou DNA) -> genetická diverzifikace. Role of R-M systems in the evolution of new strains. The horizontal transfer of DNA in bacteria increases the genetic diversity among them. A bacterial cell which acquires a new R-M gene complex (right) becomes genetically isolated from its clonal population (left). The MTase component of the newly acquired R-M system modifies the genome. Owing to this change in the methylation pattern, the REase prevents the genetic exchange of alleles between closely related strains. Furthermore, mutations acquired in these populations would facilitate genetic diversity, resulting in different genotypes. These populations would further evolve into different strains. Potenciální role R-M systému a fágů v přechodu od RNA k DNA genomům A)Protobuňka s RNA genomem je parazitována RNA fágem. Obrana buňky vznikem REasy a MTasy (první R-M). B)Virus se adaptuje přechodem na U-DNA. Buňka převezme DNAP pro tvorbu U-DNA od fága a poté v rámci obrany přejde na DNA s Tymidinem a změnou R-M syst. C)Virus se adaptuje přechodem na T-DNA. Obrana buňky vznikem moderního R-M systému (REase + Metyltransferase) D)Virus se adaptuje modifikací DNA. Závody ve zbrojení mezi buňkou a virem ve využívání různých R-M systémů. DNAP Gen pro U-DNA DNAP DNAP = DNA polymerase/replicase Role of R-M systems in genome evolution. The probable role of defense systems in the evolution of genomes is depicted. (A) Initially, RNA viruses coexisted with bacteria containing RNA genomes. With the evolution of uridine-containing DNA (U-DNA) genomes in bacteria and the acquisition of RNA-dependent endonucleases, a primitive R-M system could have ensured the restriction of the RNA viruses. (B) Such a selection pressure would enforce the evolution of a U-DNA genome in viruses to evade this primitive R-M system. This in turn would result in the evolution of thymidine-containing DNA (T-DNA) genomes in bacteria to evade phage infection. (C) The phage adapts to the host defense strategy by evolving a T-DNA genome. (D) Continuous selection would result in an “arms race” between bacteria and viruses, resulting in the utilization of modified DNA bases in phage and bacterial genomes. Role parazitů v evoluci genomů „major evolutionary transitions“ Maynard Smith Přechod od k Příspěvek mobilních elementů 1 Malé virům podobné replikátory Protobuňka První replikátory podobné virům, + podvodníci – parazité hned na úsvitu -> Kompartmentalizace pod tlakem parazitů 2 Protobuňka Prokaryotická buňka Závody ve zbrojení -> vznik R-M systémů -> přechod k DNA genomu Separace templátů a katalyzátorů (vznik translace) Velké genomy pro zajištění kooperace genů 3 Prokaryotická buňka Eukaryotická buňka Vznik intronů II z Mobilních elementů -> toxické mRNA -> oddělení transkripce a translace jadernou membránou, spliceosom, NMD Linearizace genomu (obrana proti letálním následkům rekombinace intronů), exaptace Group II RT pro telomerázu Meiotické geny (od archeálních plazmidů, které byly bez HGT pod silnou selekcí na účinnost svého replikačního aparátu) Epigenetické systémy pro modifikaci DNA z R-M systémů (rekombinace, duplikace) 4 Jednobuněční Mnohobuněční Programovaná buněčná smrt infikovaných buněk jako altruistická odpověď na genetické parazity (u všech buněčných organismů), z TA systémů plazmidů •Mít transpozony je evoluční adaptace, která zvyšuje evoluční potenciál. •Všechny organismy, které se zbavily TE, nakonec vymřely (třídění z hlediska stability – J. Flegr, J. Toman)