ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primem a sond Design primerů a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR - Sekvence - Koncentrace solí -Tvorba heterodimerických stabilních struktur - Párování bazí - nejen Watson a Crick - Sekundární struktura -Teplota tání DNA Tm Design primerů a sond Melting temperature Tm •jeden z nejdůležitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm - teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting" - usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: A=T < G=C • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovými molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) Tm=81,5+16,6 (loglO[Na+]+0,41(%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory http://inSiliCO.ehU.es/tm.php Tm Temperature abs.(T] abs.[25*C] Design primerů a sond Melting temperature Tm 100 80 S 60 w o % o ♦ 40 c 'c O 20 Tm lower in lower salt concentration Tm higher in higher salt concentration 60 70 80 90 100 110 GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC GCTATTCAACTGGAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG T -25° m >T m T*-25° m >T m GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG T note: is 4° lower than Tm (In general, there is a 1° drop for every 1 % mismatch) Design primerů a sond Gibbsova (volná) energie a její změna •Schopnost látek jít do reakce •Sekundární struktura DNA • AG závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie AG° (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teploty a tlaku) - spontánní reakce - AG<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček - predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions - smyčky, vlásenky, výdutě atd. Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 1. Počet odpovídajících párů bazí Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence - nearest ne ig h bor 3. Sekundární struktura Charakter cílové sekvence Kompetice primeru nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce Interakce mez 5' a 3' konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 5. Iontová síla Koncentrace iontů, zejména Mgll+ Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA - vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hybridizace obou primerů. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou AG°, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající AG°. Design primerů • Optimálně: primery jejichž 5'konce tvoří stabilní duplex, AG° <10 kcal/mol/37°C • Plynulý přechod AG° směrem k 3'konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3'konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primerů - primer dimery • Specifita - hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí - i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR -vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR CCCCATGCTTACAAGCAAGT r; Design sond • Různý design podle toho, zdaje cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy - LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový proces - denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší AR (ARn) • Umístění 5' konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3' konci jednoho z primem - účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence - začlenění LNA, PNA nebo MGP • G - účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém • Tm proby od 10°C vyšší než Tm primem Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) Sondy by měly být umístěny co nejdál od primeru 5' - odečet fluorescence v annealingové fázi GC 50% Každá sonda má délku 23-35bp Sondy o stejné Tm - musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10°C vyšší než Tm primerů 3' konec akceptorové sondy fosforylován Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění FRET) Template DNA i! i i i i i rr Excitation for donor FRET lllllllll^^JJlllIIlllll Emission by acceptor Detection Temperature Design molekulárních majáků Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu Tm komplementárních ramen o 7-10°C vyšší než Tm primem Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye R Quencher Dye Sonda připojena k 5' konci primem a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy OK I I Sequences producing significant alignments: [Click headerg to jort: oolxuma) Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Transcripts NM 005252.2 Homo sapiens v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog (FQS), mRNA 40.1 40.1 100% 0.014 100% XM 001713466.1 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC10012S91S (LOC10012S91S], mRNA 32.2 32.2 80°': 3.5 100% KM 001717510.1 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC100128913 (LOC10012891S), mRNA 32.2 32.2 80% 3.5 100% XM 001716725.1 PREDICTED: Homosapiens hypothetical protein LOC10C12391S (LOC1CC12391S), mRNA 32.2 32.2 80% 3.5 100% NM 0177S0.2 Homo sapiens chromodomain helicase DNA binding protein 7 (CHD7), mRNA 30.2 30.2 75% 14 100% NM 182923.3 Homo sapiens kinesin light chain 1 (KLC1), transcript variant 2, mRNA 30.2 3C 2 75% 14 100% NM 005552.4 Homo sapiens kinesin light chain 1 (KLC1), transcript variant 1, mRNA 30.2 3C 2 75% 14 100% KM 001725819.1 PREDICTED: Homo sapiens hypothetical protein LOC10C131402 (LOC1CC131402), mRNA 23.2 23.2 70% 55 100% XM 001725069.1 PREDICTED: Homosapiens hypothetical protein LOC100131402 (LOC100131402], mRNA zs.z Z3.Z 70% 55 100% Genomic sequences [sh qw first] NW 001838113.2 Homo sapiens chromosome 14 genomic contig, alternate assembly (based on HuRef SCAF_11 40.1 901 100% 0.014 100% NT 026437.11 Homo sapiens chromosome 1+ genomic contig, reference assembly 40.1 3647 :cc°: 0.014 100% NW 001838847.2 Homo sapiens chromosome 2 genomic contig, alternate assembly (based on HuRef SCAF_110 34.2 258 100% 0.89 100% Design primerů a sond Design primerů - web resources Primer Bank httrj://rjqa.mqh.harvard.edu/primerbank/ MB TtoCrntcrforCori and Integrative Biology Primer Bank PCR Primers for Gene Expression Detection and Quantification Links Citation Policy Help/FAQ Primer Search Search for PCR Primers Search where GenBank Accession 0 Species [All Species 0 Order Oligos You can haue primers s\ nthesized and PCR r* DNA Core Facility • RTPrimerDB http://medqen.uqent.be/rtprimerdb/ • Real Time PCR Primer Set http://www.realtimerjrimers.orq/ • QPPD http://web.ncifcrf.qov/rtrj/qel/primerdb/default.asrj BTPtuwOe 19 ([WOlit MM tor Wlrn«« «W cSVWGfMflt raqntin Hftuiautw Prooes Wotecular fWMonllo pievenllme-ioniurnioi) i íi. sňalo nnoOLX* a certain le.ti of unltoiniib Jna slaDCUroMMon among Meteni b h im m i '■" mm Cwrenti 'í".c.isíinm»prHi«»(*lM;.)g7 j«n*t » miieh iiSmíirtOí. ifri people * PAlTYtl I SPtltUHI F DtP»ÍPt * t .'"ÍCtSOMPELÉ J (JOul) HTPrmerOU ti • Plimi f ROSCHE CHT P SHIEUUI F M P-ÍPE « ťvWDCSOWELf J OWX fo-nw ma piíBi UXUl ttu*oc liceai TOM MlEWC JtOO) JWMI Real Time PCR Primer Sets I Wimé Primer Sets for Quantitative Real Time PCR Are you normalizing gene expression to just one housekeeping gene? Set of 10 Validated Housekeeping Gene Primer Sets - Only $79.95 Available at www.realtimeprimers.com Mil) GoqaTt STBR Green Primers Hybridi/allon Probes Hydrolysis Probes I Modular B—cort» ] pufamt PrtmfBJProb«»] | Lints | Quantitative PCR Primer Database Search Primer Design primem a sond Design primerú a sond- web resources Primer?: WWW primer to « WL» pr->r, ahfaf ACCTXarni ■ ■ n*n )ntm m»i-d in S - h FA1) T A inml c± rVwNflBlrs^ iiqm (mM Alt'i. USIl i«r )a Primer 3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3 www.cqh rilpiHdublpiiHb^. fV± htridirMior,[robi- i*jb)a usr(ftp .■ Pkt nptcpkiH «ih right pnbu opposite sbmQ AmtltOi wound *( J bmti a pMncoB M ad M Or mk 4k h il-*[indj«|. ATCTrCCCCJTCAT i id Sir* Br KTOil CCCC Primer Express http://www.appliedbiosvstems.com Premier Biosoft International http://www.premierbiosoft.com PlwfalSllf \h IM Oft1?* Mk ■Miff T" ***—- * Ml J ímhkv 93 Grnrrfll Pnmrr PitkUí ť tin "O 0«l HD Mu e: PffcrtToi Xfc Opr Ue řlUI.-! ... ■ V„ ■ .f Mt« MmMTC^iiriamiiMY '« li I fclasttľmib. (JiHiidrTmv4 Pradfr 0 ÍHlua* ľ«JKtr(lflh tř*»n WD *i..x,,nu ümn. ' LitrnltSnu *í-Utfcmw Ir? PREMIER Biosoft International PRODUCTS SERVICES DOWNLOAD ORDERING Software to Accelerate Research in Life Sciences AllelelD® ■ Real Time PCR & Microarrays Array Designer ■ Microarrays ] Beacon Designer™ ■ Real Time PCR. Qligo Design PrimerPlex ■ Qligo Design for xMAP® Based Multiplex Systems Primer Premier ■ PCR Primer Design ■ MS/MS Data Analysis ■ Draw Plasmid Maps & Plan Cloning Experiments ■ Tissue Hicroarray Data Analysis mer ■ Tagged Primer Design SimGlycan™ I SimVector TMA Foresight Xpression Pri Design primem a sond Návrh primem a TaqMan sond - Primer Express 61 121 181 241 301 3 61 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 / clij xrel = rrUniIJT!J:47741brr 1090. .5-1143 /gene="FQS" / gene_synonyin- " AP-1" /gene_synonyrri="C-FOS" /stanclard_naTňe=rrBP2 5GG15A10G9rr /db Kref-rrUniSTS:S19218rr atgatgttct tccccggccg ggctcgcctg attcccacgg ctcgtctcct ccctccgctg cagagcattg agaatccgaa ct.gact.gata accgagattg cgacctgcct cttgatctga ctgcctctcc agcatggagc agtggctctg gcagactggg gagcccctgt ttcgtcttca ggcagcagca tga cgggcttcaa gggatagcct tcaacgcgca tcactgccat ctgtggcccc gggcttactc gcaggagggg gggaaaggaa cactccaagc ccaacctgct gcaagatccc ctgggggcct tcaatgaccc tgaagaccga agacagcccg agcctctgca gcactccggt cctaccccga gcaatgagcc cgcagactac ctcttactac ggacttctgc ctcgaccagt atcgcagacc cagggctggc caaggtggaa taagatggct ggagacagac gaaggagaag tgatgacctg gccagaggtt tgagcccaag gccctttgat ctccgtgcca cagtggctcc ggtcacctgt ggctgactcc ttcctctgac gaggcgtcat cactcacccg acggacctgg ccggacctgc agagcccctc gttgtgaaga cagttatctc gcagccaaat caactagaag gaaaaactag ggcttcccag gccaccccgg ccctcagtgg gacttcctgt gacatggacc ctggggatgg actcccagct ttccccagct tcgctcagct cctcccgctg cagactcctt ccgtctccag agtggctggt accctttcgg ccatgacagg cagaagaaga gccgcaaccg atgagaagtc agttcatcct aagagatgtc agtctgagga aacctgtcaa tcccagcatc tatctgggtc ggcccatggc gcactgctta gtgcagctgc cacccacgct cagcagcgcg ctccagcatg tgccaacttc gcagcccgcc agtccccgcc aggccgagcg agagaaaagg gaggagggag tgctttgcag ggcagctcac tgtggcttcc ggccttcacc gagcatcagc atccaggccc cttctatgca cacagagctg cacgtcttcc ccaccgcaag gctggccctg Disclaimer | Write to the Help Desk NCBI | NLM | NIH Primer Express® Software for Real-Time PCR Version 3.0 ©Copyright 2004. Applied Biosystems. All rights reserved Elli Primer Express 3.0 Qd(x File E dit View T cols Window Help □ afl|8>|XEíax i 1 ► H si -► 4- El JJ & ^ $W» ÜTäqMan® MGB QuantificBtion # 1 [TJfn)f><) Sequence: Parameters Primers I Probes Order 0) File Nome | g 1144 □ Double Stranded ...............T....... kTGATGTTCT CAGCAGCGCG CAGACTCCTT ľlCGGACCTGG ctcgaccagt ctgtggcccc ccctccgctg aggccgagcg cagaagaaga gcagccaaat ggagacagac ccaacctgct cgacctgcct tgtggcttcc agtctgagga ccctcagtgg gccctttgat Lgacagcccg gcagactggg CGGGCTTCAA TCCCCGGCCG CTCCAGCATG CCGTCTCCAG CCGGACCTGC ATC GC AC-AC C GGGCTTACTC CAGAGCATTG AGAGAAAAGG GCCGCAACCG CAACTAC-AAG GAAGGAGAAG GCAAGATCCC CTTGATCTGA GGCCTTCACC AACCTGTCAA GACTTCCTGT CTCCGTGCCA AGCCTCTGCA CGCAGACTAC GGGATAGC CT GGCTCGCCTG TGCCAACTTC AGTGGCTGGT AGAGCCCCTC CAGGGCTGGC GCAGGAGGGG AGAATCCGAA GAGGAGGGAG ATGAGAAGTC GAAAAACTAG TGATGAC CTG CTGGGGGCCT CTGCCTCTCC GAGCATCAGC TCCCAGCATC GACATGGACC CAGTGGCTCC GAGGCGTCAT CTCTTACTAC TCAACGCGCA ATTCCCACGG GCAGCCCGCC ACCCTTTCGG GTTGTGAAGA CAAGGTGGAA GGGAAAGGAA CTGACTGATA TGCTTTGCAG AGTTCATCCT GGCTTCCCAG GCCAGAGGTT TCAATGACCC AGCATGGAGC ATCCAGGCCC TATCTGGGTC CTGGGGATGG CCTCCCGCTG CACTCACCCG GGACTTCTGC TCACTGCCAT CTCGTCTCCT AGTCCCCGCC CCATGACAGG CAGTTATCTC TAAGATGGCT CACTCCAAGC ACCGAGATTG GGCAGCTCAC AAGAGATGTC GCCACCCCGG TGAGCCCAAG TGAAGACCGA AGTGGCTCTG CTTCTATGCA GGCCCATGGC 11' i. 150 200 250 300 350 400 450 500 550 650 700 750 '.' 900 950 Design primerů a sond JTaqMand) MGB Quantification # 1 | Sequence |i Parametersi| Primers / Probes | Order( Parameter Value Min Primer Tm 58 Max Primer Tm 60 Max Difference in Tm of Two Primers 2 g Primer GC Content Min Primer %GC Content 30 Max Primer %GC Content 80 Max Primer 3' GC's 2 Primer 3' End Length 5 Primer 3' GC Clamp Residues 0 Min Primer Length 9 Max Primer Length 40 Optimal Primer Length 20 0 Primer Composition Max Primer G Repeats 3 Max Num Ambig Residues in Primer 0 g Primer Secondary Structure Max Primer Consec Base Pair 4 Max Primer Total Ease Pair 8 0 Primer Site Uniqueness Max % Match in Primer 75 Max Consec Match in Primer 9 Max 3' Consec Match in Primer 7 □ Probe Tm Min Probe Tm 68 Max Probe Tm 70 0 Probe GC Content Min Probe ZGC Content 30 Max Probe ZGC Content 80 g Probe Length Min Probe Length 13 Max Probe Length 25 □ Probe Composition Max Probe G Repeats 3 Max Num Ambig Residues in Probe 0 No G at 5' End in Probe 0 Select Probe with more C's than G's □ □ Probe Secondary Structure Max Probe Consec Ease Pair 4 Max Probe Total Base Pair 8 g Amplicon Min Amplified Region Tm 0 Max Amplified Region Tm 85 Min Amplified Region Length 50 Max Amplified Region Length 150 g General Max Primers I Probes 50 Design primerů a sond JTaqMan® MGB Quantification # 1 I Sequence[ Parameters! Primeľs 1 P'obes f Order] 0 [-Candidate Primers & Probes [ft [[FwdStart ][FwdStop ][FwdLen... jfFwdTm ][ Fwd %GC ~][ Fwd Seq ][RevStart [[RevStop ] [Řev Len... [fRevTrn ][ Rev %GC ~][ Rev Seq [[Probe 1 162 181 20 58 |55 CGTCTCCA... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 2 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 182 3 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 4 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 5 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 6 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 7 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 8 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 9 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 10 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 11 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 13 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 14 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 15 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 16 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 17 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 18 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 19 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 20 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 21 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 22 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 24 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 25 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 2G 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 822 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 28 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 29 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 30 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 31 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 < > [TjClick to show Locations [F]Click to show Secondary Structures Design primerů a sond Name Value 0 Forward Primers Total primers tested: 35792 GC test passed: 35149 Ambiguity test passed: 963 Clamp test passed: 963 Tm test passed: 963 Avoid Excluded regions test passed: 963 Repeat test passed: 900 Self compare test passed: 741 Limit GC test passed: 214 Sequence compare passed: 84 Reverse sequence compare passed: 83 □ Reverse Primers Total primers tested: 35296 GC test passed: 34657 Ambiguity test passed: 946 Clamp test passed: 946 Tm test passed: 946 Avoid Excluded regions test passed: 946 Repeat test passed: 861 Self compare test passed: 703 Limit GC test passed: 205 Sequence compare passed: 95 Reverse sequence compare passed: 95 0 Primer Pairs Total pairs tested: 7885 Amplicon Length test passed: 691 Avoid Excluded regions test passed: 691 Tm Difference test passed: 691 Amplicon Tm test passed: ■-■ T_LJ_1=1_1_ 630 0 TaqMan Probes Total probes tested: 14450 GC test passed: 14128 Ambiguity test passed: 1178 Tm test passed: 1178 Avoid Excluded regions test passed: 1178 Repeat test passed: 1126 Self compare test passed: 1076 Sequence compare passed: 475 Reverse sequence compare passed: 458 Probe start test passed: 351 Design primerů a sond B C D E F G H 1 J K L M N O P Q R S T U V w X Y 1 # Fwd Start Fwd Stop Fwd Length FwdTm Fwd %GC Fwd Seq Rev Start Rev Stop Rev Length Rev Tm Rev%GC Rev Seq Probe Start Probe Stop Probe Length Probe Tm Probe %GC Probe Seq Amp T~ AmplíGC Am p Ta Amp Len Penalty 2 1 152 181 20 58 55 CGTCTCCAGTG CCAACTTCA 217 199 19 58 63 G GTCCG GACTG GTCGAGAT 183 197 15 69 67 TCCCACGGTCACTGC _84 61 62 56 31 3 2 151 180 20 59 60 CCGTCTCCAGTG CCAACTTC 217 199 19 53 63 GGTCCGGACTGGTCGAGAT 182 197 16 69 63 TTCCCACGGTCACTGC _85 61 62 57 36 4 3 151 180 20 59 G C CCGTCTCCAGTG CCAACTTC 217 199 19 53 63 G GTCCG GACTG GTCGAGAT 183 197 15 69 67 TCCCACGGTCACTGC _85 61 62 57 36 5 745 762 18 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 509 790 20 59 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 780 16 65 50 TGTCAAGAGCATCAGC _83 57 61 65 77 e 5 745 762 18 53 Gl CCCAAG CCCTCAGTGGAA 509 790 20 59 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 781 17 69 -7 TGTCAAGAG CATCAG CA 33 57 61 65 77 7 e 745 762 18 53 Gl CCCAAG CCCTCAGTGGAA 509 790 20 59 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 732 13 69 50 TGTCAAGAGCATCAGCAG 33 57 61 65 77 S 7 800 322 23 60 -5 AG CCCTTTGATGACTTCCTGTTC 564 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAG G CCCAGTG _84 60 62 65 30 9 s 800 222 23 60 +5 AG CCCTTTGATGACTTCCTGTTC 564 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 13 70 61 ATCATCCAG G CCCAGTGG _84 60 62 65 30 10 ■=t1- 3 300 745 322 752 23 18 60 53 43 61 A n ncmrn ath ArTTnrrnTTr CCCAAG CCCTCAGTG G AA Rftd 310 JU7 791 7S1 --IS. 20 _5a -60- r: r; r-, i--r-, r-, r-. r-T^Trrrí n ň -TZ - - - i i i ZTZ G GTCTTC ^ _323. _SAS. U. 6R fil TCATnrAn n nncAnTr, n TGTCAAGAG CATCAG C 34 62 E2 65 30 12 n 745 762 13 53 £i UUUAAUUUUl uAU 1IJIJAA -sw -79T -20" -53: -so- ATl. AAA^ ^ ^ ..Tl. \z \z 1 1 LA -T6T -73T IT -ET - IGlCAAťAtJčATCA5ČA S3 5E 60 66 32 13 12 7^5 762 18 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 310 791 20 55 se ATCAAAG G G CTCG GTCTTCA 765 7S2 15 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG _83 56 60 66 32 14 13 7^5 762 18 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 780 16 65 50 TGTCAAGAG CATCAG C _83 56 60 66 33 15 i- 7^5 762 18 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 731 17 69 -7 TGTCAAGAGCATCAGCA _83 56 60 66 33 16 13 7^5 762 18 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 310 790 21 59 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 782 15 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG S3 56 60 66 33 17 16 733 821 23 60 4S GAG CCCTTTG ATG ACTTCCTGTT 564 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 15 7C 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 34 61 62 66 55 13 17 793 821 23 60 4S GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 364 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 525 345 15 7C 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG _84 61 62 66 35 19 ia 733 821 23 60 -3 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 364 847 IS 59 G7 GGAGCGGG CTGTCTCAGA 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G _84 61 62 66 55 20 13 7^5 762 18 53 Gl CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 20 55 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 780 16 65 SO TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 67 87 21 23 745 762 18 53 Gl CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 20 55 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAG CA S3 57 61 67 87 22 21 745 762 18 58 Gl CCCAAGCCCTCAGTGGAA 811 792 20 55 55 CATCAAAG G G CTCGGTCTTC 765 782 IS 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG S3 57 61 67 87 23 22 733 818 21 59 52 CG AG CCCTTTG ATG ACTTCCT 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 820 835 16 63 SO TTCCCAGCATCATCCA 85 61 62 67 88 24 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 18 59 G7 G GAG Ĺ G G G CTGTCTCAGA 820 836 17 69 53 TTCCCAGCATCATCCAG 85 61 62 67 33 25 24 733 818 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 821 835 15 69 53 TCCCAG CATCATCCA 85 61 62 67 88 26 23 733 213 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 IS 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 821 836 16 69 56 TCCCAGCATCATCCAG 85 61 62 67 33 27 23 798 213 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 IS 59 G7 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 834 13 69 62 CCCAGCATCATCC 85 61 62 67 33 28 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 85 61 62 67 S3 29 23 733 818 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 IS 59 G7 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 18 70 61 ATCATCCAG G CCCAGTGG 85 61 62 67 33 30 23 733 818 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 _18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 829 845 __17 69 65 TCATCCAG G CCCAGTGG _85 61 62 67 33 31 3 C 745 762 18 58 ei CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 55 50 TCATCAAAG G G CTCG GTCTT 765 780 16 65 50 TGTCAAGAGCATCAGC 82 56 60 65 92 32 31 745 762 18 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 55 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 781 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAG CA _82 56 60 65 92 33 32 745 762 18 58 Gl CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 55 50 TCATCAAAG G G CTCGGTCTT 765 782 18 69 50 TGTCAAGAGCATCAGCAG _82 56 60 65 92 34 33 737 816 20 53 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 G7 GGAGCGGG CTGTCTCAGA 820 335 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA _85 62 62 65 92 35 3i 737 816 20 53 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 GGAGCGGG CTGTCTCAGA 32C S3S 17 69 53 TTCCCAGCATCATCCAG _85 62 62 65 92 36 33 797 316 20 53 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 335 15 69 53 TCCCAG CATCATCCA _85 62 62 65 92 37 35 737 316 20 53 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAGCATCATCCAG _85 62 62 65 92 33 37 737 316 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 334 13 69 62 CCCAGCATCATCC _85 62 62 65 92 39 32 797 816 20 55 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 335 15 65 6 C CCCAG CATCATCCAG _85 62 62 65 92 40 33 797 816 20 55 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 323 337 15 65 6 C CCAG CATCATCCAGG _85 62 62 65 92 41 -3 737 816 20 55 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 340 14 65 64 CATCATCCAGGCCC _85 62 62 65 92 42 -1 737 816 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 342 16 65 63 CATCATCCAG G CCCAG _85 62 62 65 92 43 42 737 816 20 55 55 CCGAG CCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 344 18 7C 61 CATCATCCAGGCCCAGTG _85 62 62 65 92 44 43 737 816 20 55 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 828 345 18 7C 61 ATCATCCAGGCCCAGTG G 35 62 62 65 92 45 " 737 316 20 55 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 829 345 17 69 65 TCATCCAGG CCCAGTG G 35 62 62 65 92 46 45 737 816 20 55 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 364 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 830 345 16 65 63 CATCCAGGCCCAGTG G _85 62 62 65 92 47 46 322 822 23 60 -3 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 367 851 17 59 71 CACGG AGCG G G CTGTCT 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG _84 60 62 65 96 43 47 322 822 23 60 43 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 367 851 17 59 71 CACG G AG CG G G CTGTCT 828 845 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 60 62 68 96 49 48 322 822 23 60 43 AG CCCTTTG ATG ACTTCCTGTTC 867 851 17 59 71 CACGG AGCG G G CTGTCT 829 845 17 69 65 TCATCCAG G CCCAGTG G 84 60 62 68 96 50 49 796 816 21 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 820 835 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 61 62 69 98 51 52 796 816 21 59 52 ACCGAG CCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 G GAG C GGGCTGTCTCAGA 820 836 17 63 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 62 69 98 5? Design primerů a sond Applications & Technologies Log In or Register to see your product prices St to place orders. Learning Si Events Enter search term Products > Real-Time- PCR > Gene Expression Assays, Plates & Arrays > Assays :> TaqManig Gene Expression Assays TaqMan® Gene Expression Assays Click a tab below to learn more about TaqMan Gene Expression Assays. To find and order assaysr click the Search tab Ordering Information Product Description Assay Search To begin, select a search method below - Keyword: Search by gene symbol, gene name, public accession number, biological process, or molecular function, - Batch ID: Search by uploading a file containing multiple assay IDs, RefSeq accession numbers, GenBank GI #sF LocusLink IDs, gene symbols, IMAGE Clone IDs, or species. Keyword Search | Batch ID Search Search for I All Te^~ |n| Disable wildcard search + Advanced Keyword Search www.appliedbiosystems.com Choose Species [ Filter by Am pi icon Lengths [P] H. sappers [P] A. thaliana □ Amplicon length less than 70 3 P- norvegicus ^] D. melanogaster H] Amplicon length between 71 and 35 [h] m. musculus [T] C. elegans □ Amplicon length between S6 and loo [n] m. mulatta [Rhesus) [T] C. familiaris [Canine) [h] Amplicon length greater than or equal to 101 □ D. reria [Zebrafish) O E. taurus (Cow) PJ G. gallus [Chicken) [rj O- cuniculus [Rabbit) |T| B. scrofa [Pig) Choose Set Membership ) Search All Assays [excludes Gene Copy Number Assays] ) Search Gene Copy Number Assays 3 Limit Assay Sets to: TARGET CLASS ASSAY ATTRIBUTE r] Apoptosis r] Ambion siRNA □ Fusion Transcripts □ Endogeno Controls M ICRDARRAY VALIDATION □ 1700 |rj 3' Most COLLABORATOR SETS P] Immune Tolerance I.et-.-cr-i n] Mammalian Gene Collection Order q Information Assay Search Product Description Specifications Litera tu re'Support ch \c-Fds In t to refir^^cur ss ' other criteria, s Your search Fo^^-Fos in All Text ' returned 2.7 results. ( Species: Homo sapiens Amplicon Length: ALL Set Membership: ALL ) If you ■wish to reFir^^rour search results by product availability, click a radio button below, and then click Filter Results. To filter your suits by other cr^faria. select from the categories list to the left of your results. Related Products Search Help Previous | 1 | 2 | Ne*± View Results by Category All Results/ Panther Classification: ■ Panther Function [26) ■ Panther Process (26) Inventoried Assays Made to order Assays 1 Im entoried and Made to order Assays ^^r^ľter Results | Please Log In to add products to your Shopping Basket/Favorites, configure a product, or to view products available For purchase in your country. 25 items/page | T I Ja Feedback □ 1. AssavJ^^lTetails: ^^^wtto 63 0_m 1 Alignment Hap siRNAs B. Related Products Inventoried FOS v-fos FBJ AP-L NM_005252.2 5 GenBank Homo 77 murine C-FOS mRNAs sapiens osteosarcoma homolog 9 □ 2. Assay ID Details: Hs99999L40_ml Inventoried FOS v-fos FBJ AP-1 NM_005252.2 5 GenBank Homo 77 murine C-FOS mRNAs sapiens Alias ► RefSeq ► Amplicon Length □ 1 Assay ID Details: Hs00L70630_rnl Alignment Map siRNAs 6 Related Products Fnventoried FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog AP-1 C-FOS NM 005252.2 5 GenBank mRNAs Homo sapiens 77 Homo 7S Homo sapiens Design primerů a sond Roche Applied Science Czech Republic Home Products Special Interest Sites Support & Resources News <^Roche) Search ... Home > Special Interest Sites > Genomic Systems > Real-Time PCR Systems > Universal ProbeLibrary System Universal ProbeLibrary Real-Time PCR Systems ► LightCyclerS Carousel-Based System ► LightCyclerJ 480 System * Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology ► Assay Design Center ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support Gene Expression Quantification with Real-Time PCR - Simple and Fast ♦ Design real-time qPCR assays online in seconds. ♦ Rely on just 165 prevalidated probes for over five million qPCR assays for a large variety of organisms. ♦ Reduce the cost of gene expression analysis by performing multiplex qPCR assays with Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays. ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts www.universalprobelibrary.com Universal ProbeLibrary for Human Specity your target(s): -By sequence ID, gene name or keyword — e.g. ENST0CC0033-1789, NM_UQ11Q1 orX00351 orbeta-actin Roche Applied Science Acvancec ch~ier3 settings -By sequence- e.g. >part of X00351 Human mRNA fcr beta-actin CACG€CaiCGTCACCMCTGGGACGfiCATWfiGJUU^ICTG«^CaiCACCTTCTaCaai GAGCTGCGTGTGGCTCCCGA^AGOCCCCGTGCTGCEGACCGAGGCCCCCCTGAACCCC AAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCaGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCaGCCATG 1ACGTTGCIATCCAGGC1GIGCEA1CCCTG1ACGCCTCTGGCCGTACCACIGGCAICGTG A1GGACTCCGGTGACGGGGICACCCACACIGI SCCCAICTACGAGGGGl ATGCCCICCCC 0 Automatically select an intron spanning assay. G Design multiplex PCR with reference gene. Design primem a sond Real-Tims PCR Systems ► LightCycler* Carousel-Based System ► LightCycler* 4SI) System t Universal ProbeLibrary System ► System Description ► echrclccy » Assay Design Center ► Pack Inserts ► Assay Design Guide ► Quick Reference ► Probe No. Conversion ^ Need Help? ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support K Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Please choose the sequencefs] you would like to continue with. You can select up to 10 sequences. Name Length Description □ ENSTOOOrjrj 4-00991.-1 2669 □ ENST00000303562.2 2103 □ ENST00000297904.2 2110 □ NM_003367.2 1732 □ NM_207291.1 1531 □ NM 003131.2 4343 □ NM_004469.2 2128 □ ABO 22275.1 300 □ ABO 22276.1 700 AL139130.28-201 Clone_based_ensembl_transcri Transcriptional activator of the c-fos promoter CROC4 (CROC-4). [Source:UniprotrSPTREMBL;Acc:Q8N964] □ AB20912S.1 5672 □ AF126533.1 233 Homo sapie FOS-201 HC Proto-oncog fos>[G0/G1 [Source:Uni FIGF-0O1 H( endothelial i (c-fos-induc [Source:Uni| Homo sapie c-fos interac Homo sapie c-fos interac Homo sapie response el [SRF), mRN Homo sapie (vascular en mRNA. Homo sapie partial cds Homo sapie partial cds Homo sapie (c-fos serun transcription ProbeFinder has designed the optimal real-time PCR assay for: NM 003367.2 homo sapiens upstream transcription factor 2, c-fos interacting (USF2), transcript variant 1, mRNA. Assay details: Use Universal ProbeLibrary probe: #26, cat.no. 04687574001 Primer Length Position Tm %GC Sequence Left Primer 18 449 -4E6 e d 67 gt ga c c c a ggt gggt gt g Right Primer 21 540 - 560 59 43 tgaagggattttggatcacag Amplicon (112 nt) gtgacccaggtgggtgtggacggggcagcccagcgcccgggccccgccgctgcctctgtg cccccaggtcctgcagcgcccttcccgctggctgtgatccaaaatcccttca Download pack insert | | PDF report | | Text report ] [ Order probes or set Transcript overview: 26 " TTT i i ÁÁ Á A 1732 Detailed view: 2'T 43Ů ■=^441^