ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Aplikace 1. Detekce DNA Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. Detekce miRNA Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|al 95°C 1min Forward primer (10|aM) 2,0\x\ Reverse primer (10|aM) 2,0\x\ 95°C 15s PCR grade H20 15,0|al 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ) Disociační křivka - 60-95°C Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% qRT-PCR - detekční limit 1x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0|al Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0|al Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0|al Forward primer (10|aM) 2,0|al Reverse primer (10|aM) 2,0|al Sonda (20|aM) 0,2|al PCR grade H20 8,8|al Vzorek DNA nebo standard 5,0|al PCR 50°C 20min (Reverzní transkripce) 95°C 15min (Aktivace polymerázy) 95°C15s , 45X 60°C 1min Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA - Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/ - Detekce - Taqman - SNP microarray Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • 2 alelově specifické sondy které mají specifické fluorofory a PCR primery, které detekují specifický target • Vysoká specificita • Próby s MGB (minor groove binder, 3') - zlepšují hybridizaci stabilizací vazby MGB s templátem Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza '. Ass-ay components and DNAtemplate ■ Iii i FontaiTJ prlmrr E Prot» ^ n.....f1 lllh TTT^P ^„,------- ^ TT iiiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiii TTTrrrrrrrry 2. DenatiMied temp-ale and annealing assay oomponairts 5- Prot* J& ["■c -crnm prrrír ......... LI_.......■ ■ Ii'. 3. Polymerizaücn and s^uJ peneratiDn =3"*-5rt D'ircr Pinta V.......íVŕi i llllllllllíllllllllllllll I rrUllllIlUlftrrrrrrr :■ Y-rar \f Vit? CfrE ^1 FjW" (tí* in, Quencher MhyGiWrC •■'■c ~sq ľ-: :■ t_ Pro*» Undetermined • Allele X * AlleleY • Both ■ NTC -A h ■ ■ * í < 4 ■ ^ ■ M L* M 4 ■ K H ' Allele X [SNP Allele 1) Figure 1, Allelic discrimination is achieved by the selective annealing of TaqMan* MGB probes, Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • Detekce pomocí dvou majáků - 1 se váže na wt alelu, druhý na mutantní alelu • Různé fluorofory Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridizován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Aplikace SNP genotypizace SNP array Array pomocí použití tisíce prob Amplification Digestion Probe labeling B. SNP array Patient DNA SNP array I Hybridization ^ Allele A ^ Allele B Normal Deletion Duplication Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 ■u * c * o 3 Single^tranded DNA (random coils) 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] ■ oo 80 £ 60 20 25 20 15 C [I c ~z. ® /ild Typ ^alleli ^\ Mutc jnts „ i „ \ (I all Hi 3teroz^ /gote; ^\ \^ fi ? 05 3 m f\ 1=1 a oj Fi 0r i Mid types ;C allele) M \ < P yiutar T allel ts 3) / \ X > /£ M 1 Hete rozyg otes 02 8ZI 03 33.! 34 04.Í TompTHliirí; ("Q 35 85 80 80.! Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21 mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) Pre-miRNA miRNA genes Nucleus Cytoplasm ^Dicer TÍľ?TTTTT7miRNA duplex I rniíTTTľT JLuJi One strand incorporated into Rlz C RlzC^ T Target MtUh.l mRNA mRNA Translation cleavage inhibition Tumor suppressor gene ;Tumor suppressor gene expression tOncogene expression Aplikace 75 ng/ul Thymus Total RNA 40 60 Fig. 1A. Image of a typical electropherogram for small RNA analysis performed with the Small RNA Assay on the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) (http:// www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5989-7002EN.pdf). Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce Specifický primer pro RT 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA(snRNA) Ulil 111 lili -i- ____ MIM 1 i 1 Illinium III II 1 ď ^0 U18 U54 RNU58B HY3 RNU58A U75 RPL21 U47 e S F ° 5 2 © IQ to E snoRNA135 snoRNA142 snoRNA202 snoRNA234 snoRNA251 h ■ c ■a >• Ť: — r Q C5 S g - u -: J É S 1 S E 2 S 2 S 5 Human Tissues Mouse Tissue Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem 9 *_&_9 TTT i— 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace Single cell profiling tion > A B Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of \ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts ■ 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis ■glass capillaries ' flow cytometry laser capture • purification • detergents • heat • osmotic • mechanic * reverse transcriptase ► priming ' temperature profile 1 pre-amplificalion mastermix ■ priming temperature profile ■ detection chemistry pre-amp I ideation normalization quality assessment statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Droplet digital PCR Precizní sensitivní stanovení NK Kombinuje klasické PCR postupy s fluorescenčním stanovením produktu Rozdělení PCR reakce na stovky až tisíce subreakcí- někde dojde k replikace, někde ne - přítomnost/nepřítomnost hledané sekvence Subreakce individuálně analyzovány Ratio pozitivních a negativních reakcí - počáteční množství molekul templátu Absolutní kvantifikace bez externích standard ddPCR-využití • Kvantifikace virů a patogenů • Genové exprese - pokud rozdíly menší než dva krát • Copy number variations • Single cell analysis • Rare mutations.... ddPCR .Jul*:- Enzyme PCR Pringrs Deieciion sysi*fn {probe or ttya] Sample Fig. 3 Components of a Digital PCR reaction and Partitioning. dPCR reactions contain similar components to that typically used in a qPCR reaction. These components should be thoroughly mixed and then partitioned into uniform subpartitions ■COJ moo e 50O0 1 not E 2 3000 O 2000 • Ch2-Conc:1230 PoS:9887 Neg:4062 0 I . ■ ■-■ 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Evert Numoef Rg. 4 (a) Partitioned reactions are placed in a vessel compatible for the PCR amplification to take place, (b) Amplification can take place in a standard thermocyder using typical qPCR protocols. For example 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 30 s and GO °C for 1 min. No optical analysis is required at the amplification phase, (c) Individual subreactions are collected and subsequently interrogated for the presence of a positive fluorescent signal, (d) Individual reactions are deemed either a positive or negative event, counted, and trie concentration is calculated ddPCR root Chi CNV If OJConc l040Pos672?Neg6172 6000 8000 10000 Rg. 5 TemporaJ plot of a dPCR reaction. X axis represents individual subreactions in the order they were analyzed. Kaxis represents fluorescent signal generated in each corresponding subreaction. Blue dots are deemed as positive events; grey dots me deemed negative. Purple fine is the threshold for determining what is positive from negative (can be set automatically by software algorithms or manually as in the case above)