Centrifugace Literatura Centrifugace Důvodem použití centrifug je nutnost urychlit sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí. Na sedimentaci má vliv 1.vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. 2.vlastnost prostředí (rozpouštědla): hustota, viskozita Centrifugace 20. léta 20. století - Svedberg - počátky laboratorních centrifug a analytické centrifugace; teoretické základy metody 50. léta - Brakke - centrifugace v gradientu hustoty Theodor Svedberg (1884-1971) Nobelova cena za chemii 1926 pojmenována po něm Svedbergova jednotka pro vyjádření sedimentačního koeficientu Centrifugace uOdstranění hrubých částic z roztoku u Sediment (pelet) – supernatant u uIzolace organel nebo biomakromolekul u uStanovení základních parametrů – MW, hustota, sedimentační koeficient Použití Rozdělení centrifug Otáčky ® g • rad w- úhlová rychlost (rad/s) f – otáčky/min Otáčky ® g rad Preparativní centrifugace Metody nanášení vzorku Preparativní centrifuga Preparativní centrifuga allegra6 microfugelite Preparativní ultracentrifuga optpg4_2 Rotory uÚhlový – diferenciální centrifugace u uVýkyvné – zonální centrifugace u uZonální – bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru Úhlový rotor • optpg2_2 differential_f4 differential tj25_1c1 Diferenciální centrifugace uopakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí otáček = gravitací u Výkyvný rotor • tj25_1b1 optpg2_3 density_gradient_f2 densgrad Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální Gradientová centrifugace média uKriteria pro výběr centrifugačního media: umusí v roztoku tvořit gradient unesmí interferovat se vzorkem umusí být lehce odstranitelné ze vzorku u Gradientová centrifugace média uSacharosa uGlycerol u uFicoll - dextran uPercoll – SiO2 u uCsCl uCs2SO4 • Hypertonické prostředí • Nutno připravit gradient Gradient vzniká během centrifugace • Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Diferenciální versus gradientová centrifugace Zonální rotor Zonální rotor Centrifugace se zonálním rotorem Centrifugace se zonálním rotorem Centrifugace se zonálním rotorem Analytická ultracentrifugace Analytická ultracentrifugace Analytická ultracentrifugace Analytická ultracentrifuga optima_xli Optický systém Optický systém Optický systém •Absorbční optický systém §UV-VIS od 200 do 800 nm detekce makromolekul obsahujících silný chromofor • •Rayleighův interferenční optický systém §měří změny indexu lomu analýza makromolekul neobsahujících silný chromofor (např.polysacharidů) nebo vzorků obsahujících v pufru silně absorbující látky (např.ATP/GTP, DTT oxidovaný) Optický systém Zkřížená optika Interferenční optika Fotografiký systém Absorbční systém • Analytická ultracentrifugace Metoda sedimentační rovnováhy • Metoda sedimentační rovnováhy • uTermodynamické informace (závisí na Mr) uExperimentálně lze stanovit : u •Relativní molekulovou hmotnost – sacharosa Mr (Mr = 360) až po viry (Mr = mnoho milionů) •Stav molekul v roztoku - asociace •Rovnovážné konstanty v roztoku K à výpočet volné energie asociačních reakcí Metoda sedimentační rovnováhy • Metoda sedimentační rychlosti • Metoda sedimentační rychlosti • Metoda sedimentační rychlosti • uHydrodynamické parametry (závisí na Mr a tvaru molekuly) uExperimentálně lze stanovit : •Sedimentační koeficient s •Difuzní konstantu D nebo frikční faktor f •Relativní molekulovou hmotnost Mr •Tvar molekuly v roztoku