Fluorescenční měření přenosu DHE pomocí proteinu kryptogeinu

V prvním měření bude analyzován transport sterolů mezi micelami. Principem je připravit dva druhy
micel, mezi kterými by mohla probíhat výměna sterolů, a pomocí fluorescenčního měření kvantifikovat
míru vlivu b-cryptogeinu na tento transport. Budou použity fluorescenční, samozhášivé micely
tvořené dehydroergosterolem a nefluorescenční micely, obsahující dva různé sterolů. Měření je
založeno na faktu, že dehydroergosterol podléhá jevu samozhášení, při výměně sterolů mezi dvěma
druhy micel se od sebe molekuly dehydroergosterolu vzdálí, a fluorescence se tedy zvyšuje. Jako
negativní kontrola bude použit aprotinin, což je podobně jako b-cryptogein malý bazický protein,
který nevykazuje podobnou sterol transportní aktivitu. Měření bude prováděno na fluorimetru
Fluoromax-4 od firmy Horiba (Horiba, Japonsko) při excitační vlnové délce 325 nm a emisní 370 nm.
Budou prováděny tři sady měření, ve všech budou fluorescenční micely tvořeny dehydroergosterolem.


Nefluorescenční micely budou tvořeny pro první sadu měření cholesterolem, pro druhou
beta-sitosterolem. Tyto steroly budou rozpuštěny v methanolu. Měření bude probíhat v kyvetě
s 1,2ml 10mM MES pufru o pH 7,0. Výsledná koncentrace DHE v měřené směsi bude 0,63 μmol/l a
výsledná koncentrace sterolů bude 3 μmol/l. Nejdříve bude měřen pouhý pufr, následně bude přidán
DHE spolu s dalším sterolem v odpovídající koncentraci a bude změřena basální hodnota fluorescence,
která odpovídá spontánnímu transportu, následně bude přidán b-cryptogein a bude měřena změna
fluorescence. Rozdíl naměřené hodnoty od bazální bude odpovídat míře schopnosti b-cryptogeinu
transportovat steroly mezi micelami.


Diagram fluorescenčního měření přenosu sterolů










Strukura dehydroergosterolu (A), beta-sitosterolu (B) a cholesterolu (C)

Fluorescenční měření přenosu NBD-PC pomocí proteinu kryptogeinu

V dalším experimentu bude měřena schopnost b-cryptogeinu katalyzovat transport lipidů mezi
akceptorovými a donorovými unilamelárními váčky. Váčky budou připraveny následujícím způsobem: pro
donorové váčky bude 0,32 mg fluorescenčně značeného fosfatidylcholinu (NBD-PC), 0,08 mg
fosfatidylserinu a 0,16 mg cholesterolu rozpuštěno v chloroformu. U akceptorových váčků bude použit
neznačený fosfatidylcholin (PC) místo značeného. Chloroform bude odpařen pod proudem dusíku. Po
odpaření budou přidány 2 ml 10mM MES pufru a směs bude sonikována. Měření bude prováděno
v 1,2ml MES pufru o pH 7,0 v míchané kyvetě. Excitační vlnová délka bude nastavena na 460 nm a
emisní bude nastavena na 534 nm. Do každé kyvety bude přidáno 10 µl směsi obsahující NBD-PC a 17 µl
směsi obsahujíxí PC. Pro každé jednotlivé měření budou naměřeny hodnoty fluorescence před a po
přidání b-cryptogeinu a z nich bude následně spočten rozdíl.


Diagram fluorescenčního měření přenosu NBD-PC.


16:0-06:0 NBD PC

16:0-06:0 NBD PC
(1-palmitoyl-2-{6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine)