Biotransformace
Matouš Čihák


2
Biotransformace
Teoretický úvod
•
Biologický činitel pro biotransformaci
Mikroorganismus
Tkáňová kultura
Bezbuněčný extrakt
Purifikovaný enzym
•
•Biotransformace (biokatalýza) je selektivní enzymová modifikace čistých látek vedoucí ke vzniku
definovaných konečných produktů.
•
•Biotransformaci zprostředkovává biologický činitel.
Doporučená literatura:
Smitha MS, Singh S, Singh R. Microbial bio transformation: a process for chemical alterations. J
Bacteriol Mycol Open Access. 2017;4(2):47-51 DOI: 10.15406/jbmoa.2017.04.00085

3
Biotransformace
Teoretický úvod
•
Hlavními směry aplikace biotransformací jsou:
A.specifické modifikace struktury molekuly (např. selektivní zavedení funkční skupiny),
B.částečná degradace molekuly,
C.rozšíření molekuly.
•
Z hlediska typů transformovaných látek se jedná nejčastěji o:
•Steroidní látky
•Antibiotika
•Alkaloidy
•Aminokyseliny
•Sacharidy
•Terpenoidy
•Aromáty a heterocykly

4
Biotransformace
Teoretický úvod
Blokové schéma předcházející výroby pro různé formulace biokatalyzátorů. Přerušované čáry označují
volitelné kroky (lyofilizace) a tečkované čáry rozlišují extracelulární nebo intracelulární expresi
proteinu
 *Lyofilizovaný bezbuněčný extrakt je upřednostňovanou formulací pro delší použití, skladování
enzymů a snadnější manipulaci v procesu.

5
Biotransformace
Teoretický úvod – Charakteristika biotransformačních reakcí
Reakční podmínky
Mírné
·Teplota <40 °C
·pH 7
·atm. tlak
Specifita reakce
Vysoká (stereospecifita, specifita místa účinku)
·Produkce chirálních produktů (L-jablečná kys.)
·Modifikace jediného enantiomeru v racemické směsi (D-, L-aminokyseliny)
·Specifické zavedení funkční skupiny (D-sorbitol ↔ L-sorbosa, Acetobacter suboxydans)
·Mutační biosyntéza (mutovaný mikroorganismus vyžadující konkrétní prekursor)
Substrát
Ideálně netoxický a snadno procházející membránou (viz také případové studie)
Mikroorganismy
Ideálně s širokou nabídkou metabolických drah (např. půdní bakterie Streptomyces) a schopností
růstu na běžných substrátech.

6
Biotransformace
Teoretický úvod – Typy biotransformačních reakcí
Typ procesu biotransformace
Výhody
Nevýhody
V rostoucí kultuře
·Substrát společně s inokulem
·Rychlý screening
·Substrát nesmí inhibovat růst inokula
·Tvorba vedlejších produktů
·Degradace produktu
S předem narostlými buňkami
·Možnost optimalizace výtěžku
·Vysoká koncentrace buněk
·Malé nebezpečí kontaminace
·Relativně snadná izolace produktu
·Časová náročnost (1. fáze nárůst biomasy, 2. fáze biotransformace)
·Nutná izolace biomasy
·Tvorba vedlejších produktů
·Degradace produktu

7
Biotransformace
Teoretický úvod – Typy biotransformačních reakcí
Typ procesu biotransformace
Výhody
Nevýhody
S imobilizovanými buňkami
·Vyšší stabilita systému/enzymu
·Možnost kontinuálního provedení
·Vysoká hustota buněk i vyšší reakční rychlost
·Není nutná izolace enzymu
·Přirozená dostupnost kofaktorů oproti imobilizovaným enzymům
·Nutná optimalizace postupu imobilizace
·Tvorba vedlejších produktů
·Degradace produktu
·Nevhodné pro extracelulární enzymy a živočišné a rostlinné
S purifikovanými enzymy
·Aplikace pro substráty, které nepřechází přes membránu intaktní buňky
·Živočišné nebo rostlinné enzymy
·Komerční dostupnost
·Možnost imobilizace
·Suplementace kofaktory

8
Biotransformace
Příklad – Antibiotika
·Příprava polosyntetických preparátů. Proč?
oLepší farmakokinetické vlastnosti (vstřebávání, eliminace)
oVyšší účinnost (aktivní vůči rezistentním mikroorganismům, širší účinnost, nové účinky)
oNižší toxicita
·Využití biotransformace při přípravě strukturně odlišných antibiotik ampicilinu a amoxicillinu.
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cc/PenicillinPSAedit.jpg Chart: China Dominates
the Antibiotics Market | Statista

9
Schematic representation for large-scale production of Penicillin G (reproduced and redrawn from
elsewhere [30]). Steps are self-explanatory. For a detailed account, see the source [30]. “OUR”:
oxygen uptake rate, “OTR”: oxygen transfer rate, “MCB”: master cell bank, and “MWCB”:
manufacturer’s working cell bank. Miniatlas mikroorganismů Cell Bank Preparation and
Characterization - BioProcess InternationalBioProcess International Drug manufacturing
“OUR”: oxygen uptake rate
“OTR”: oxygen transfer rate
“MCB”: master cell bank
“MWCB”: manufacturer’s working cell bank.

10
Schematic representation for large-scale production of Penicillin G (reproduced and redrawn from
elsewhere [30]). Steps are self-explanatory. For a detailed account, see the source [30]. “OUR”:
oxygen uptake rate, “OTR”: oxygen transfer rate, “MCB”: master cell bank, and “MWCB”:
manufacturer’s working cell bank. 6 Aminopenicillanic Acid - an overview | ScienceDirect Topics

11
Enzymatická příprava ampicilinu z penilicinu G
V čem spočívá výhoda ampicilinu oproti penicilinu G?

12
Biotransformace
Příklad – Antibiotika
File:Penicillin-G.png - Wikimedia Commons
Penicilin G

Přehled penicilinů
13
základní peniciliny
penicilin G, penicilin V
antistafylokokové peniciliny
oxacilin, cloxacilin, docloxacilin, flucloxacilin
širokospektré peniciliny
aminopeniciliny
ampicilin, amoxicilin
karboxypeniciliny
ticarcilin
acylureidopeniciliny
piperacilin

14
Separace a čištění produktů
Případové studie
Problém
Příčina
Řešení
·Bakteriální kultura je v přítomnosti substrátu inhibována v růstu.
·Toxický substrát.
·Aplikace substrátu po ukončení růstu.
·Postupné dávkování.
·Nízký výtěžek biotransformace při použití buněčné kultury.
·Substrát neschopný transportu dovnitř buňky.
·Použití bezbuněčného enzymového extraktu.
·Použití purifikovaného enzymu.
·Modifikace substrátu.
·Nízký výtěžek biotransformace.
·Substrát je hůře rozpustný ve vodě.
·Použití smáčedla (Tween).
·Použití netoxických rozpouštědel mísitelných/nemísitelných s vodou.
·Žádaný produkt není jediným konečným produktem.
·Vznik vedlejších produktů z důvodu nedostatečné specificity enzymové reakce.
·Příprava mutantních kmenů/GMO syntetizujících žádaný produkt jako konečný v metabolické dráze.

·GMO producent pro biotransformaci neroste na transformovaném substrátu
·Ztráta schopnosti růstu na transformovaném substrátu
·Návrat k původní kryokultuře.
·Posílení stability kmene.

>