PROTOKOL Produkce rekombinantního proteinu v bioreaktoru Pichia pastoris 1. Přiložte graf(y) s průběhem parametrů kultivace a okomentujte jednotlivé fáze fermentace. Escherichia coli 1. Přiložte graf(y) s průběhem parametrů kultivace a okomentujte jednotlivé fáze fermentace. 2. Pomocí excelového souboru „simulace exponenciálního příkrmu“ ze zadaných parametrů (Y[X/S][ ]= 0,357 g g^-1, c[x,DCW,0] = 8,93 g l^-1, c[s,0][ ]= 1 g l^-1, c[s,f][ ]= 700 g l^-1, µ[set] = 0,15 h^-1, V[R,0] = 1 l) určete následující údaje: a) rovnice exponenciálního příkrmu pro q[S,f]; b) rovnice exponenciálního příkrmu pro v[pum], c) rovnice exponenciálního růstu m[x,DCW]; d) doba příkrmu potřebná pro dosažení cca 100 g buněk; e) koncentrace buněk na konci exponenciálního příkrmu; f) maximální dosažená rychlost pumpy; g) konečný objem bioreaktoru; h) množství glukosy přidané pumpou. Uvažujte 17 h příkrm a 6 h produkční fázi, ve které je rychlost přídavku substrátu 50 ml h^-1. 3. Semilogaritmickým proložením potvrďte exponenciální růstovou křivku a určete maximální specifickou rychlost růstu vsádkové fáze v bioreaktoru. Výsledek diskutujte. Proč nelze zcela stejné určení specifické rychlosti růstu využít i během příkrmové fáze? K čemu slouží zastavení přídavku substrátu v souvislosti se sledováním odezvy signálu pH? K jakým dalším změnám dochází po vyčerpání substrátu? Purifikace rekombinantního proteinu 1. Pomocí získaných dat během izolace a purifikace rekombinantních proteinů doplňte následující tabulky: Kryptogein Metoda Koncentrace proteinu [mg ml^-1] Objem [ml] Množství proteinu [mg] Výtěžek [%] Extracelulární medium 100 % IEC Glukosaoxidasa Metoda Koncentrace proteinu [mg ml^-1] Objem [ml] Množství proteinu [mg] Výtěžek [%] Buněčný extrakt 100 % IMAC SEC 2. Přiložte a popište chromatogramy IMAC, SEC a IEC purifikace rekombinantních proteinů. 3. Přiložte a popište SDS-PAGE gel a Western Blot. 4. Okomentujte výsledky exprese a purifikace rekombinantních proteinů a možnosti dalšího postupu k získání čistého nativního proteinu.