Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (sekundární, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct…)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– Evoluce (alignment sekvencí)
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let) o
komplexu (nebo proteinu) - konzultace
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
4.05.2023 přednáška „Přehled nástrojů pro bioinfromatickou analýzu komplexů“
11.05.2023 9.00 hod C2-2.11 zkouška (test + prezentace)
- podobně jako srovnání morfologie organismů (fenomů),
také srovnání genomů/proteomů ukazuje na vývoj „evoluci“ v
čase (genů/proteinů)
- divergence druhů koreluje do značné míry s
konzervací/divergencí DNA/proteinových sekvencí
- způsobené „nestabilitou“ DNA (… oprava poškození)
- DNA je replikována s relativně vysokou přesností (1 změna
na 109 nukleotidů – cca4000 TNR12 písmen na A4 stranu –
8000 TNR12 na list – 500listů/balík – cca 250 balíků)
- umožňují „vylepšující“ změny (adaptace)
Dr.Šebesta–poškozeníDNA
Evoluce
mutace virů ukazují jejich
úlohu pro „adaptabilitu“ na
prostředí … hlavní roli však
hrají jiné změny …
- velmi příbuzné sekvence DNA/proteinů mezi člověkem a
primáty díky „krátké“ době, po kterou mohlo k mutacím
docházet (jsou zachovány i nukleotidy ve 3. pozici
synonymních kodonů - odhad 1/400AMK protein za 200,000 let)
- druhovou rozdílnost nezpůsobuje mnoho mutací v
sekvencích proteinů (nemohlo jich tolik vzniknout), ale …
Figure 4-76 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Evoluce – mutace
- odlišnost druhů je dána spíše rozdílnou regulací
(nekódujícími sekvencemi), tj. rozdílem v expresi proteinů
než rozdílem v sekvenci proteinů (tj. rozdílnou funkcí proteinů)
- rozdílná exprese tj. rozdílné proteomy v buňkách podmiňují
odlišnost buněk v organismu (svaly, játra …) i odlišnost buněk
v čase a prostoru (morfogeneze – odlišný vzhled, vývoj …
mozek => menší problém když se modifikuje/zmutuje program
morfogeneze než když zmutuje protein => vliv na funkci)
- srovnání sekvencí (člověk a myš) ukazuje odlišnější
nekódující sekvence než protein-kódující (regulační
sekvence jako promotor …, intron je odlišnější než kódující
exon) - silnější selekční tlak na proteiny
Figure 4-78 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
- frekvence mutací by byla +/stejná
podél molekuly DNA … ale
různé proteiny jsou různě
změněné díky selekčním tlakům
– (histony … kvasinkový a lidský
ubikvitin se liší třemi AMK, 6 ze 7
změn v cytochromu C jej
poškodí)
- čím důležitější a komplexnější
funkce proteinu pro organismus
(od nejzákladnějších po
specializované) tím více je
konzervovaná sekvence proteinu
(respektive jeho domén)
Evoluce – selekce
- takto konzervované proteiny
jsou lehce identifikovatelné v
různých organismech a mají
„homologní“ (ortologní) funkci
- např. některé lidské proteiny
funkčně zastoupí
zmutované/deletované
kvasinkové proteiny (Y2H
cytotrap)
- konzervace je důsledkem
„purifikační selekce“ (eliminace
buněk/jedinců s mutacemi v
esenciálních/důležitých funkcích)
- mutace u pacientů s různými
syndromy …
Evoluce – selekce
- purifikační tlak na proteinové
sekvence pro udržení jejich
funkce:
- „tlak“ na strukturu proteinu
(více mutací ve smyčkách),
- selekční tlak na povrch proteinu
= tj. na interakce a PTM
- mutace, které „neruší“ jsou
neutrální (protein je částečně
modifikován)
- modifikace je kompenzována (i
později) mutací partnera
- změní se v čase a v budoucnu
může přinést novou vlastnost
Evoluce – selekční tlak
- purifikační tlak na proteinové
sekvence pro udržení jejich
funkce:
- „tlak“ na strukturu proteinu
(více mutací ve smyčkách),
- selekční tlak na povrch proteinu
= tj. na interakce a PTM
- nejpomaleji se mění proteiny,
které jsou zapojeny do nejvíce
interakcí s dalšími proteiny
(limitována, jak struktura, tak
povrch) - není příliš prostoru pro
změny - např. ubikvitin, histony
… („drží“ základní systém)
Evoluce – selekční tlak
- nutnost zachování funkce
neposkytuje příliš prostoru pro
evoluci/rozvoj nových vlastností
(ale neznamená ani selekci na
„nejstabilnější“ či „nejaktivnější“ =
určitá volnost)
- neutrální mutace neruší
strukturu či interakce proteinu
- taková změna ale může v
budoucnu přinést novou vlastnost
v alignmentu se podívejte na
pozice konzervovaných AMK v
3D modelu/struktuře
Evoluce – selekce
S
A
V
C
I
…RYBY, OBOJŽIVELNÍCI, PTÁCI …
- mutace specifické AMK na Ala
zruší Nse3-Nse4 interakci
- „mutace“/změny těchto AMK
na podobné (hydrofobní) AMK
tyto interakce neruší
Hudsonetal,PLoSOne,2011
blízké organismy Nse3
O
B
R
A
T.
KVASINKY … určitá volnost v obsazení AMK
Guerineau et al, PLoS One, 2012
„kompenzační“ mutace?
O
B
R
A
T
k
v
a
s
- „mutace“/změny těchto AMK na
odlišné (polární Thr nebo posun
motivu o 1AMK na konci)
- pořád vytváří stejný komplex
(interakční partner se také „mění“)
- „mutace“/změny zřejmě koevolvují
- teorie kompenzačních mutací …
Vazební partneři ko-evolvují
Madaouietal,PNAS,2007
Aakre et al, Cell, 2016
- nutnost zachování funkce nesvědčí o „kompenzačních
mutacích“ (mutace v jednom z proteinů přímo kompenzována
mutací v partnerském proteinu) – „kompenzace“ přichází
postupně přes „promiscuous intermediate“ mutace
Aakre et al, Cell, 2016; Akiva a Babbit, Cell, 2015
- „promiscuous intermediate“
mutace jednoho proteinu
mohou být doprovázeny
„promiscuous“ mutacemi
druhého proteinu, ale
nedochází ke ztrátě PPI
„promiskuitní“ mutace
„promiskuitní“ mutace
Aakre et al, Cell, 2016; Akiva a Babbit, Cell, 2015
- „promiscuous intermediate“ může rozšířit interakční spektrum =
může interagovat i s duplikovaným proteinem (např. tkáňově
specifickým – specifický komplex)
- později se může „oddělit“ a vytvořit nový komplex
(paralelní ko-evoluce = drift)
Tori
Tnew
Aori
- selekční tlak na stabilitu a funkci - nutnost zachování funkce
neposkytuje příliš prostoru pro evoluci/rozvoj nových vlastností
- pro rozvoj nových vlastností, nových druhů - spíše než
druhově specifické mutace proteinů lze vidět expanzi různých
genových/proteinových rodin v různých živočišných druzích
(různé kopie mají různé funkce - paralogy)
(příklad superrodiny jaderných hormonálních receptorů)
Figure 4-85 Molecular Biology of the Cell (2008)
Vznik proteinových rodin
Duplikace a divergence (neo- a sub-funkcionalizace)
- hlavními tahouny evolučních procesů jsou duplikace
(všechny geny/proteiny jsou „potomky“ několika ancestrálních
genů/proteinů (foldů), které existovaly v nejčasnějších živých
formách
- (nyní cca 1000 foldů na >100000 struktur v PDB, odhad je
cca 2000 foldů))
- po duplikaci jsou oba proteiny stejné - vytváří stejný
homo(di)merní komplex – později jeden protein diverguje
(mutace) a vzniká hetero(di)mer
- duplikace více genů/proteinů (podjednotek) … komplexů
Marsh et al, ARB, 2015
prokaryota eukaryota
homo
hetero
cca 30% genomu S.c. je „duplikováno“ => došlo k
celogenomové duplikaci (WGD) => a poté došlo k
přeskupování a redukci segmentů (i chromosomů) – polyploidie
u kytek …
Celogenomová duplikace (u kvasinek)
Ancestrální
chromosom
- následují mutace – inaktivující tj. pseudogeny (ustaví hladinu proteinu zpět na
původní) nebo nefunkční (zatěžují expresní-chaperonový aparát – snaha odstranit)
- duplikace ALE … – na počátku stejné sekvence = stejné
funkce - vyšší hladina proteinu/ů může být toxická
(aneuploidie – kvasinky s 1 chromosomem navíc, nádorové buňky)
- nadbytek proteinů (např. transkripčních faktorů) nebo
nerovnováha podjednotek komplexů znamená disregulaci
některých procesů
Shelzeretal,Science(2011)
„duplikace“ chromosomu - aneuploidie
Duplikace segmentů a genů
- duplikace segmentů: např. rozdíl v genomu člověka a
šimpanze je především v duplikaci 30Mbp – cca 50kbp
segmenty - nikoli v jednotlivých mutacích tj. SNPs
- duplikace individuálních genů - reverzní transkripcí a
integrací DNA
- duplikace domén = exonů – přidají se do sekvence genu =
protein s novým uspořádáním domén
-
dospělýplod
Duplikace reverzní transkripcí a integrací DNA
- duplikované geny mají na počátku stejné sekvence = stejné
funkce (pod jinými promotory – jiný lokus tzn. jiné „okolí“
zaintegrované „mRNA“ tzn. jiná regulace exprese – „nové“
buňky) – postupné mutace a další odlišení
Příklad: Evoluce globinů
Evoluce rodiny globinů (duplikace)
- červy, hmyz a primitivní ryby mají jeden globin (150AMK)
- vyšší obratlovci mají α- a β-globin (tvoří α2β2 komplex –
účinnější přenos kyslíku) – vyvinul se u vyšších ryb (500Mya)
Figure 4-86 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
homo- na heteromery
Evoluce rodiny globinů (duplikace)
- … u savců se dále duplikoval β-globin, který je exprimován
specificky v embryu – má vyšší afinitu ke kyslíku a napomáhá
přenosu kyslíku z krve matky do krve plodu
- dále se duplikoval a specializoval na časná vývojová stádia
α2ε2 a pozdější α2γ2 - k další duplikaci došlo u primátů α2δ2
dospělýplod
Shuffling domén
- hranice domén jsou většinou kódovány introny – bez intronů
by bylo obtížnější přesně vybrat pouze „doménovou“ část
- „shuffling“ domén (inzerce/delece) – poskládají se nové
geny/proteiny – vytváří nová funkční/fyzická provázání
(interakce => nové „prosíťování“ interaktomů)
David Potěšil - Proteomika
Duplikace domén
- většina domén v proteinech obratlovců pochází/existuje v
bezobratlých – pouze 7% lidských proteinů/domén je
specifických pro obratlovce)
- fůze domén naznačuje funkční příbuznost nebo dokonce
přítomnost v komplexu (v organismu s nefůzovanými
doménami - ChimeraDB)
Tucker et al, TiCB, 2001
- WGD vede více k redundanci a sub-funkcionalizaci
- WGD zachovává duplikáty komplexů (kvůli zachování
stechiometrie podjednotek komplexu – při genové erozi se ztrácí
více geny mimo komplexy)…
- více-podjednotkové komplexy jsou pod větším tlakem (musí
zároveň „zachovat“ více vazeb „najednou“) než méněpodjednotkové
komplexy
- duplikace jednotlivých genů vedou
více k diverzifikaci funkce
- duplikace domén (shuffling) vede k
neo-funkcionalizaci a k přemodulování
(rewiring) interaktomu
Evoluce interaktomu
Vo et al, Cell, 2016
RNA polymerasy
Pol I = 11 + A49/34.5
Pol II = 11 podjednotek (Tabulka)
Pol III = 11 + C37/53 + C82/34/31
TFIIF
TBP
TFIIB
TFIIE
Vannini & Cramer, Mol Cell, 2012
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
TBP
TFIIATFIIF
TFIIB
- TFIIF se váže na pol II, stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a
pomáhá TFIIB s nastavením startu
- v pol I a III jsou paralogy TFIIF součástí komplexu polymerázy
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
mitochondriální vakuolární
podobné proteinové komplexy – tzv. AAA ATPasy
jsou součástí jiných komplexů (v jiných
procesech):
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků
- „denaturace“ DNA: helikásy (MCM …)
- v opravě poškozené DNA: Rad51, RecA
- …
vytváří ATP vytváří pH gradient
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- ATPasové pumpy …
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků …
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- … patrně se vyvinuly z RNA helikásy (RNA
svět) přes (RNA, protein) translokásy,
ATPasové pumpy …
Souhrn
Průběh evoluce je ovlivněn mnoha faktory
- Selekční tlaky udržující funkční a stabilní (dříve
vytvořené) proteiny a komplexy
- Mutace modifikující proteiny/komplexy (drift) jsou
eliminovány u esenciálních proteinů
- Zatímco duplikované mohou podléhat mutacím „volněji“
- Duplikace a neofunkcionalizace (mutace) je hnací silou
vzniku nových proteinů (nové kombinace domén) komplexů
– funkcí – typů buněk - organismů
Praktické implikace (pro zkoušku)
- analýza sekvenční podobnosti (stupeň konzervace)
- napoví o přítomnosti domén (alignment – podobné AMK,
doplnit analýzou sek. a terc. struktury)
- projekce podobnosti do 3D modelu (ConSurf, PatchFinder) konzervovaná
struktura tj. vnitřní AMK držící fold (u
ortologů i paralogů)
- konzervované PPI kontaktní zóny na povrchu proteinu
(povrchové AMK jsou konzervované pouze u ortologů – ne u
paralogů - pokud jsou v alignmentu i paralogy, pak podobnost
neuvidíte)