Proteínové komplexy v DNA replikácii Barbora Štefanovie, Ph.D. 6.4.2023 CG030 Struktura a funkce proteinových komplexů Replikácia • základná funkcia bunky = špecifikovať biochemické vlastnosti transkriptóm + proteóm = zabezpečenie a regulácia biochemických procesov v bunke • pokračovanie v dcérskych bunkách = potreba replikácie • replikácia = duplikácia genómu materskej bunky a jej prenos do dcérskej bunky • presnosť verzus mutácie • mechanizmy DNA replikácie sú vysoko konzervované Trošku histórie • replikácia študovaná od objavenia double-helix štruktúry • Watson & Crick, Nature, 1953: „It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.“ • každé vlákno slúži ako templát pre syntézu druhého komplementárneho vlákna = semikonzervatívny model • topologický problém –aby sa mohla DNA replikovať, je potrebné rozpletenie dvojšroubovice = zapletenie vlákien a rotácia • pre predstavu: 1 otáčka/10 bp, kompletná replikácia DNA molekuly ľudského chromozómu 1 (250 Mb), by vyžadovala 25 miliónov rotácií • naopak cirkulárna dsDNA (baktérie, bakteriofágy) bez voľných koncov nemôže rotovať = nereplikuje sa podľa scény Watsona-Cricka • Je navrhnutá dvojšroubovica skutočná štruktúra DNA??? Plektonemické vs. paranemické vinutie DNA © https://www.vedantu.com/question-answer/which-of-the-following-is-a-type-of-coiling-class-12-biology-cbse-5f3a1c52f2247610961041d5 Meselson-Stahl experiment 1958, Nature značenie DNA pomocou 15N + centrifugácia v gradiente CsCl = odlíšenie rodičovských a dcérskych DNA molekúl Replikácia DNA je semikonzervatívna (Watson and Crick, 1953, Nature) DNA topoizomerázy • znižujú nadmerné vinutie, ktoré vzniká pri pohybe replikačnej vidlice • zlom + znovu-spojenie vlákien • kovalentná väzba v aktívnom mieste enzýmu • 2 typy: typ I -zlom v 1 vlákne DNA IA –prenos cez zlom (počet vinutia -1), Top3 IB –rotácia okolo neporušeného vlákna, hlavné topo eukaryot typ II –zlom v oboch vláknach (IIA, IIB, počet vinutia -2) © 2017 Genomes 4, T.A.Brown Human topoisomerase IIα cryo EM structure, 3.6 Å Vanden Broeck et al, 2021, NatComm Human topoisomerase IIα cryo EM structure, 3.6 Å Vanden Broeck et al, 2021, NatComm DNA replikácia v číslach Prokaryota (E.coli) • Genóm 4.5x106 bp • Presnosť 10-9-10-11 errors/bp • Rýchlosť ~ 60 kb/min • Počiatok replikácie: 1 • 30 min/celý genóm Eukaryota (človek) • Genóm 3x109 bp (700 x väčší) • Presnosť 10-6 errors/bp • Rýchlosť ~ 1-2 kb/min • Počiatok replikácie: 30000-50000/b.cyklus • 8h/celý genóm Figures from: Daniel Yuen at David Tribe Derivatives and Catherinea228 Dr. B. Fristensky and N. Brien, https://home.cc.umanitoba.ca/~frist/PLNT3140/l12/l12.html DNA replikácia 5' → 3' • kontinuálna vs. diskontinuálna replikácia (leading vs lagging strand) • Okazakiho fragmenty (200/1000-2000 nts) (Okazaki et al, 1968, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.) © 2014 Nature Education Adapted from Pierce, Benjamin. Genetics: A Conceptual Approach, 2nd ed. All rights reserved. Fáze DNA replikácie 1. iniciácia - začiatok už v M/G1 (licensing), rozpletenie dvojšroubovice DNA, vznik replikačnej vidlice a naviazanie enzymatického komplexu 2. elongácia -pridávanie nukleotidov a postup replikačnej vidlice (topologický stres, ťažko replikovatelné lokusy, proteíny na DNA, transkripcia, poškodená DNA) 3. terminácia - ukončenie replikácie Proteínové komplexy • ORC1-6 • MCM2-7 helikáza • pre-RC ORC1-6, CDC6, CDT1, MCM2-7 • pre-IC MCM2-7, DDK, CDKs, TOPBP1, GINS, CDC45, Treslin • Replizóm –primáza, polymerázy, RPA, PCNA, RFC • Histon remodelačné komplexy • Chromatin remodelačné komplexy Fragkos et al, 2015_MolCellBiol Počiatky replikácie • ARS Autonomously Replicating Sequences • v kvasinkách S.cerevisiae (cca 400) a príbuzných druhoch Saccharomycotina • miesta, do ktorých sa viaže ORC (pomocou WH domén a AT hookov) • 100-200 bp • A element (11 bp) vysoko konzervovaný 5' T/A T T T A Y R T T T T/A 3‘ (Y –pyrimidín, R-purín) Vyššie eukaryota –konzervovanosť sa vytratila • bohaté na A/T –ľahká väzba proteínov (narušenie vodíkových väzieb), rozhoduje epigenetika • Early replicating regions: H3K4me1/2/3, H3K9ac, H3K18ac, H3K36me3,a H3K27ac euchromatin • Late replicating regions: H3 a H4 hypoacetylácia, H3K9 a H3K27 metylácia často tkanivovo-špecifické Méchali, 2001_NatRev_Genetics Metódy štúdia počiatkov replikácie: SNS-seq –short nascent strand seq Bubble-seq –seq replikačných bublín Origin licencing /Origin firing • M/G1 fáza • Origin licencing = označenie všetkých potenciálních počiatkov (ORC + inaktívna MCM2-7) • Origin firing = výber aktívnych počiatkov, na ktorých dôjde k vytvoreniu replikačnej vidlice a syntéze DNA • ostatné počiatky –backup pre prípad spomalenia alebo zastavenia susedných replikačních vidlíc • mechanizmy, ktoré zabraňujú nedostatočnej alebo naopak nadmernej DNA replikácii • aktivovaných len 10-20% (cicavce) MCM2-7 Técher and Pasero_2021_Cell Iniciácia 1. naviazanie MCM2-7 helikázy vo forme dvojitého hexaméru na DNA označenú pomocou ORC (origin recognition complex) 2. naviazanie ďalších pomocných faktorov a vytvorenie preiniciačného komplexu (pre-IC) 3. preskupenie MCM komplexu (inaktívna/aktívna helikáza) 4. „priming“ DNA replikácie upravené z Fragkos et al, 2015_MolCellBiol Domain architecture of DmORC subunits and Cdc6 upravené zo Schmidt and Bleichert_ 2020_NatComm ORC Origin Recognition Complex - viaže sa na DNA v počiatkoch replikácie, remodeluje DNA, rekrutuje Cdc6 a MCM2-7 helikázu - ATPáza (AAA+ rodina) Orc1-5 - pentamérny kruh - evolučne príbuzné - AAA+ modul, C-term. WH -prvý kontakt s DNA - otvorená (aktívna) vs.uzavretá (auto-inhibovaná) konfigurácia - Orc1 BAH doména –nukleozóm-remodelačná aktivita (H2A,H2B) - Orc1, Orc5 viažu ATP, len Orc1 má ATPázovú aktivitu Orc6 - odlišný pôvod, viaže sa na okrej pentaméru -interakcia s ORC3 - esenciálna pre udržanie pre-RC komplexu BAH = bromo-adjacent homology domain IDR = intrinsically disordered region BP = basic patch TFIIB = transcription factor IIB-like domain DNA sa viaže do centra pentaméru a dochádza k jej ohybu →rekrutovanie MCM2-7 + Cdt1 AAA+ modul • ATPases Associated with diverse cellular Activities • proteinová rodina, spoločný konzervovaný modul cca 230 aa • využívajú chemickú energiu z hydrolýzy ATP ku konformačným zmenám, ktoré následne pôsobia jako mechanická sila na iné makromolekulárne substráty • translokázy, helikázy,… • Walker A -GXXXXGK[T/S] • Walker B -hhhhD[D/E], h = hydrofóbna aa • SRH = second region of homology • Sensor 1, AF (Arginine Finger) –hydrolýza ATP • Sensor 2 a 3 Miller et al_ 2016_Archea (Vancouver B.C.) ORC D. melanogaster upravené zo Schmidt and Bleichert_ 2020_NatComm cryo EM  ORC1  ORC2  ORC3  ORC4  ORC5  ORC6  CDC6 ORC S.cerevisiae upravené z Feng et al_ 2021_NatComm Comparison of DNA binding by ORC complex D.melanogaster vs S.cerevisiae Feng et al_ 2021_NatComm MCM2-7 -helikáza • MiniChromosome Maintenance • Archaea: 6 identických podjednotiek, hneď aktívna SS, Sulfolobus solfataricus • Eukaryota: podjednotky: 5-3-7-4-6-2 ring • sama o sebe nemá helikázovú aktivitu • potrebuje Cdc45 a GINS • rodina AAA+ ATPáz • 3' → 5' helikáza • iniciácia (preRC ) + elongácia (CMG) • postupuje s replikačnou vidlicou Loading v G1 • pomocou ORC-Cdc6 komplexu (ATPázová aktivita Cdc6) • Cdt1 (Chromatin licensing and DNA replication factor 1) • sumoylácia Mcm3 podjednotky = zabránenie predčasnej aktivácie Aktivácia počas S fáze • fosforylácia pomocou Cdc7/Dbf4 komplexu • origin firing Zhai et al_ 2017_MolCell MCM2-7 –štruktúra podjednotiek N-koncová doména NTD - interakcia medzi MCM podjednotkami • A -α-helixy, regulácia helikázovej aktvity • OB fold –väzba na ssDNA • Zinc-binding motif -stabilizácia N-koncov a komplexu • N-koncový β-hairpin -interakcia s DNA C-koncová doména CTD • AAA+ ATPázová doména - evolučne konzervovaná Walker A (väzba ATP), H2i -helix 2 insertion β hairpin (väzba DNA), Walker B (hydrolýza ATP), PS1 -presensor 1 (väzba DNA), RF -arginine finger • Degenerovaná Winged Helix - proteín-interakčné motívy Riera et al_ 2017_GenesDev Aktivácia MCM helikázy S.cerevisiae: • Cdt1 –väzba na N-koncové regióny Mcm2, Mcm6 a Mcm4 = stabilizácia, single hexamer (SH) je naviazaný na ORC-Cdc6 v replikačných počiatkoch = ORC–Cdc6– Cdt1–MCM2–7 (OCCM) komplex • naviazanie druhého MCM2/7 komplexu a tvorba „head-to-head“ dvojitého hexaméru (DH) = pre-replikačný komplex (pre-RC) • pre-RC nemá helikázovú aktivitu až do S-fáze • G1/S-fáza –DDK (Dbf4-dependent kinase) + S-CDK (Sphase-specific cyclin-dependent kinase) = tvorba dvoch aktívnych Cdc45–Mcm2–7–GINS (CMG) helikáz (pre-IC) Kang et al_ 2014_MolCell Riera et al_ 2017_GenesDev interactions via NTD ZFs hinder ring opening MCM2-7 –cryo-EM štruktúra, S.cerevisiae Noguchi et al_ 2017_PNAS Kontakty s DNA: - ZF (zinc finger) - H2I (helix 2 insertion loop) - PS1 (presensor 1) A lagging-strand DNA extrusion model Noguchi et al_ 2017_PNAS I. – konformačné zmeny spôsobené naviazaním aktivačných faktorov – presunutie lagging-strandu II. - naklonenie a posunutie N-vrstiev MCM2-7 kruhov, vytlačenie lagging-strandu cez Mcm2-Mcm5 „brány“ III. - dve aktívne helikázy putujú proti sebe v smere 3'→ 5' IV. - obojsmerný pohyb replikačnej vidlice CMG komplex • MCM2-7 hexamér • GINS komplex • Cdc45 • Cdc45 a GINS sa viaže na NTD MCM komplexu • helikázová aktivita na dsDNA • Cdc45 a GINS spôsobuje: -remodeláciu MCM dvojitého hexaméru (DH) -vyššiu affinitu MCM DH k DNA • CMG ostáva naviazaný na DNA až do terminácie replikácie –ubikvitinácia = degradácia Sun et al_ 2016_Nucleus Cdc45 Cell Division Cycle 45 - konzervovaný - dve RecJ-like α/β domény oddelené krátkou helikálnou inter-doménou (ID) - ID stabilizuje NTD domény Mcm2 a Mcm5 - protruding helical motif (PHM)stabilizácia Polε - Meier-Gorlin syndróm Bai et al_ 2017_Adv Exp Med Biol GINS • go-ichi-ni-san (5-1-2-3) = 4 podjednotky: Sld5, Psf1, Psf2, and Psf3 • má centrálný pór, ale príliš malý pre ssDNA • interaguje s Mcm3/5 na N-koncoch a s Cdc45 • slúži ako „scaffold“ pre replizóm • rekrutuje ďalšie proteiny replizómu (napr. Polα, Polε...) • GINS ani Cdc45 nemajú ATPázovú aktivitu Carroni et al_ 2017_SciRep upraveno z Bai et al_ 2017_Adv Exp Med Biol Elongácia • na vedúcom a opožďujúcom sa vlákne • väzba RPA na ssDNA –ochrana pred nukleázami a tvorbou sekundárnych štruktúr • Primáza-Polα: RNA/DNA primery na oboch ssDNA vláknach DNA • polymerázy: Polα, Polδ a Polε -syntéza • vyštiepenie primerov, dosyntetizovanie medzier • spojenie pomocou ligázy • relaxácia: topoizomerázy I a II RPA • Replication Protein A • zabraňuje tvorbe sekundárnych štuktúr • chráni ssDNA pred endonukleázami • úloha v replikácii a v oprave DNA • heterotrimér 1:1:1 RPA70 (70 kDa subunit) RPA32 (32 kDa subunit) RPA14 (14 kDa subunit) • väzba na DNA pomocou OB foldov A-E (oligonucleotide/oligosaccharide binding motívov) Pokrhel et al_ 2019_NSMB Ustilago maydis DNA Polα • nízka procesivita • bez proofreadingovej aktivity = nemá 3'→ 5' exonukleázovú aktivitu • asociovaná s primázou • inicializuje syntézu DNA na oboch reťazcoch • pre aktivitu potrebuje CMG helikázu a RPA • väzba na CMG helikázu pomocou Ctf4 homotrimeru (Chromosome Transmission Fidelity 4), ktorý je v kontakte s GINS Yuan et al_2019_eLife Primozóm = Polα-primáza • Primázový podkomplex: -človek: p49 (PRIM1) -katalytická a p58 (PRIM2) -2-10 nukleotidov dlhý RNA primer • Polymerázový podkomplex: - človek: p180 (POLA1) -katalytická a p70 (POLA2) -predĺži RNA primer =RNA-DNA hybridný primer -flexibilné linkery pre konformačné zmeny Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem Syntéza primerov I. p58C sa priblíži k p49 –syntéza RNA primeru, vytlačenie p180 podjednotky Polα II. po nasyntetizovaní 9 nts p58 inhibuje p49 III. naviazanie Polα na 9 nts dlhý RNA primer IV. predĺženie primeru (RNA/DNA) V. po nasyntetizovaní 30 nts, Polα vymenená za Polδ/Polε Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem Syntéza primerov Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem PCNA a RFC - objavené ako esenciálne proteiny pre replikáciu SV40 v ľudských buňkách • PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) - konzervovaný od Archaea až po eukaryota - kĺzavá svorka na DNA • RFC (Replication Factor C ) - ATPázová aktivita AAA+ ATPáza - 1 velká (RFC1) a 4 malé podjednotky (RFC2-5) - rozpoznáva 3' koniec primeru - konformačnú zmenu PCNA - otvára kruhovú formu za hydrolýzy ATP –loading PCNA - úloha v replikácii, v oprave DNA, v kontrole bunkového cyklu, v epigenetike - v replikácii: • upevňuje polymerázu k DNA • zabraňuje predčasné uvolnenie polymerázy z DNA • esenciálne pre výmenu Pol α za Pol δ/ɛ • výmena DNA polymeráz pri pozastavených replikačných vidlíc • PCNA je z DNA odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELG1 RFC-like komplexu Miyata et al_2004_NSMB PCNA • homotrimér • každá podjednotka má IDCL (Inter-domain connecting loop) • potrebný pre väzbu interakčných partnerov (Polδ, p21, DNA ligáza...) • C-teminálna časť: interakcia s Polɛ, RFC, ... • vnútorná časť: pozitívne nabité šroubovice–kontakt s DNA PIP box (PCNA Interacting Peptide): • Q-X-X-L/M/I-X-X-F/Y-F/Y • motív interagujúci s PCNA IDCL • DNA polymerázy, p21, Fen1, DNA ligáza... APIM (AlkB homologue 2 PCNA Interacting Motif) • proteiny zúčastňujúce sa opravy DNA PCNA kód • posttranslačné modifikácie PCNA určujúce väzbových partnerov a funkciu PCNA Dieckman et al_2012_The Eukaryotic Replisome: a Guide to Protein Structure and Function Ahmed et al_2017_NAR DNA polymerázy δ a ε • 5' → 3' DNA polymerázová akLvita • 3' → 5' exonukleázová akLvita • mutácie v exonukleázovej doméne polymeráz v nádorových bunkách • po DNA putujú pomocou PCNA • výmena polymerázy α za δ alebo ε po syntéze primeru • RFC loaduje PCNA na koniec primeru a na PCNA sa naviaže Pol δ alebo ε • Polδ syntetizuje opožďujúci sa reťazec • Polε syntetizuje vedúci reťazec • Polδ a Polε nemajú 5' → 3' exonukleázovú aktivitu, nevedia vyštiepiť primery -RNáza H1 a FEN1 • polymerázy zaplnia medzery, spojenie koncov pomocou DNA ligázy O’Donnell and Kurth_2013_Encyclopedia of Biophysics Polymeráza δ • katalytická podjednotka polymeráz: tvar ľudskej ruky: „dlaň“ je vysoko konzervovaná –polymerázová aktivita „palec“ drží DNA na mieste a zvyšuje procesivitu • 3' → 5' proofreading - oprava chýb pri replikácii, maturácia Okazakiho fragmentov • syntetizuje DNA na opožďujúcom sa reťazci až po ďalší primer • po strete s ďalším primerom dosyntetizuje ešte pár nukleotidov a vytesní časť RNA primeru • vyčnievajúci 5' koniec RNA primeru je rozpoznaný a vyštiepený FEN1 nukleázou (asociovaná s polδ) • DNA ligáza spojí Okazakiho fragmenty Lancey et al_2020_NatComm Polymeráza δ –ľudská, cryoEM Lancey et al_2020_NatComm Polymeráza ε • objavená v 1990 ako tretia DNA polymeráza esenciálna pre replikáciu S. cerevisiae • dvojnásobná veľkosť oproti Polδ • najväčšsia podjednotka (p261/Pol2) obsahuje: - NTD = katalytickú časť (syntéza a proofreading) - CTD -proteín-proteínové interakcie • pre svoju aktivitu nepotrebuje PCNA • mooring helix: - tvar L, koncová časť linkeru medzi NTD a CTD - rekrutuje Dpb3-Dpb4 podjednotky • Dpb3, Dpb4 –neesenciálne, ale udržujú rigidnú štruktúru Polε upraveno z Yuan et al_2020_NatComm • calcineurin-like PDE domain • HF – histone fold • C –C-term. region Leading ssDNA path from the CMG helicase to the Polε Yuan et al_2020_NatComm Podjednotky polymeráz H.s. vs S.c. Doublie and Zahn_2014_Front. Microbiol. Terminácia • keď sa 2 replikačné vidlice stretnú • na konci S-fáze, ale v skutočnosti v priebehu S-fáze • veľkosť replikonu: 31 kbp, rychlosť replikačnej vidlice: 1,5 kb/min • za 10 minút stretnutie dvoch replikačných vidlíc • odstránenie CMG: - Mcm7 je polyubikvitylovaná na K48 - Cdc48 rozpozná polyubikvitinylovaný CMG komplex, disociácia - PCNA je odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELG1-RFC-like komplexu • RFB (Replication Fork Barrier): - špecifické miesta genómu, ktoré dokážu zastaviť replikačnú vidlicu - pri replikácii rDNA –RF v opačnom smere ako rDNA transkripcia Dewar and Walters_2017_Nat Rev Mol Cell Biol Ľudský replizóm • model vychádzal z kvasiniek • obsahuje proteíny, ktoré nemajú ortológov v kvasinkách (rozpadnutie/stabilita replizómu, prepojenie replikácie s DNA opravou) • model vychádzajúci z cryoEM D.m. CMG: - vedúci reťazec je tlačený cez centrálny kanál MCM2-7, zatiaľ čo opožďujúci reťazec sa viaže mimo póru (MCM3 a MCM5 ZnF domény) - NTH (N-terminal hairpin) MCM7 –otočený k poslednému páru báz dsDNA –funkcia v separácii dvojšroubovice? • Polε (POLE1 = Pol2 S.c. , POLE2 = Dpb2, POLE3 = Dpb3, POLE4 = Dpb4 ) • FCP (Fork Protection Complex) -rýchly a efektívny postup replizómu, prepojenie replikácie a ďalších procesov (SCE) a aktiváciu checkpointov - TIMELESS-TIPIN (S.c. Tof1-Csm3) - CLASPIN (S.c. Mrc1) • AND-1 (S.c. Ctf4) –trimér, „scaffold“ –základňa pre väzbu ďalších proteínov na replikačnú vidlicu Jones et al_2021_EMBOJ Cryo-EM štruktúra „jadra“ ľudského replizómu Jones et al_2021_EMBOJ Replikácia v baktériách Escherichia coli • počiatok oriC (245 bp, DnaA sa viaže na 4 špecifické 9méry → rozvoľnenie DNA v 13-mérových repenciách → naviazanie helikázy • koniec Ter región naproti oriC (cirkulárny chromozóm) • DnaB = helikáza • DnaG = primáza -syntéza RNA primerov (10 nts) • SSB –tetramer, ochrana ssDNA • DNA polymerase III –heterotrimér: α, ε a θ –syntéza oboch reťazcov - PolIIIα –syntéza DNA - PolIIIε –proofreading (3' → 5' exonukleáza) - PolIIIθ –neesenciálna, stabilizuje ε • (PolIIIβ)2 –kĺzavá svorka, procesivita polymerázy • CLC (Clamp Loader Complex) –loader svorky, γ komplex Ilic et al_2018_antibiotics Replikácia v baktériách Escherichia coli https://wou.edu/chemistry/courses/online-chemistry-textbooks/ch450-and-ch451-biochemistry-defining-life-at-the-molecular-level/chapter-9-dna-replication-and-repair-2/ Replikačný stres = spomalenie alebo zastavenie replikačných vidlíc • mutácie, neobvyklé DNA štruktúry, CFS (Common Fragile Sites), konflikty replikáciatranskripcia, pôsobenie chemikálií /liekov, aktivácia onkogénov ... • kolaps replikačných vidlíc –DSB (Double Strand Breaks) –narušenie stability genómu (mutácie, Copy Number Alterations CNAs, chromozomálne preskupovanie,...) • mutácie v replikačnej mašinérii a kontrole – vývojové vady, stárnutie, anémia, rakovina,... Primo and Teixeira_ 2019_GenetMolBiol Replikačný stres Kegel and Sjӧgren_ 2010_Cold Spring Harb Symp Quant Biol Shilkin_ 2020_Biochemistry SMC5/6 v replikácii Kegel and Sjӧgren_ 2010_Cold Spring Harb Symp Quant Biol upravené z Paleček_ 2018_Genes Translokáza, ATPázová aktivita, väzba ssDNA, dsDNA Ďakujem za pozornosť!