- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF TFIIH
kvasinkový PIC komplex
Gibbons et al, PNAS, 2012
TBP
TFIIA
TRANSKRIPCE
- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA)
TRANSKRIPCE
OPRAVA DNA
Co zde schází??
Chromatin = histony …
DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
Průměrný lidský chromosom:
DNA molekula: ~4 cm
Mitotický chromosom ~4 µm
10 000x
velikosti genomů:
člověk 3 miliardy bp (x2 dipl) 2 m
fazole 13 miliard bp 9 m
lilie 90 miliard bp 60 m
salamandr <120 miliard bp 80 m
chromosom
DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
- komplexy vytvářející strukturu chromatinu
- vytváří základní strukturu
- nukleosomy – chaperony, remodelační komplexy
- histon H1, HP1 protein
- vytváří specializované domény
- centromery, telomery
- vytváří vyšší struktury a podílí se na dynamice
- SMC komplexy - kohesin, kondensin a SMC5/6
přednášky prof. Fajkuse:
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041)
chromatin
- 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
PDB: 1KX5
Skládání histonů do nukleosomu
(komplexu)
- 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou šroubovice H3
(acetylovaný K56)
Ransom et al, Cell, 2010
Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Sestavování nukleozomu:
- Silnější je interakce mezi H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a
vytváří tetramer, který asociuje s DNA
- dimery H2A-H2B se vážou následně z obou
stran tetrameru (H3-H4)2
- při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-
H2B
- H2A a H3 existují ve více variantách, které
mohou být zaměněny v nukleosomu
Ransom et al, Cell, 2010
sbalování a rozbalování nukleosomů
H3-H4
Wang et al, Prot Cell, 2015
PDB: 5C3I
ASF1 (antisilencing function)
- interferuje s tetramerizačním povrchem
- skládání (assembly i disassembly)
H3-H4
CAF-1 (chromatin assembly factor)
Složen ze 3 podjednotek (p55 podjednotka)
interferuje s vazbou H3/H4 na DNASong et al, G&D, 2008
PDB: 3C9C
H3-H4
Hondele et al., Nature, 2013
Kemble et al, Mol Cell, 2015
PDB: 4KHA
FACT (facilitates chromatin transcription)
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
interferuje s vazbou H2A/H2B …
FACT (facilitates chromatin transcription)
pomáhá při assembly …
Liu et al., Nature, 2020
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
- Asf1 moduluje H3K56 acetylaci …
- H3K56Ac interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší) – nestabilní pozice
nukleosomu je následně „upravená“ pomocí remodelačních komplexů (a
teprve poté je H3K56 deacetylován a nukleosom stabilizován)
Ransom et al, Cell, 2010
Histonové chaperony - replikace
- nukleosomy nejsou na ssDNA : replikace, oprava DNA, (transkripce) ...
- před těmito procesy se musí histony posunout nebo odstranit a poté zase
nabalit … (feedback: inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly
nukleosomů) - ASF1 (váže MCM, disassembly) + CAF1 (váže PCNA,
assembly) pro H3-H4, FACT (váže MCM - disassembly)
250-300bp – cca 1-2 nukleosomy
H3K56Ac
Histon chaperony
- funkce při replikaci …
- funkce při opravě DNA (napomáhá výměně H2A za specifický fosfo γH2AX
- … další chaperony a remodelační faktory … specifické varianty H3 a H2A
Ransom et al, Cell, 2010
Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Mattiroli et al, EMBO Rep, 2015
Histonové varianty
(u kvasinek γH2A
fosforylovaný H2A)
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice
- CENP-A (H3 varianta) má kratší šroubovici
- vazba na DNA je slabší tj. otevřenější struktura
- … jiný interakční povrch pro specifické interakční partnery …
PDB: 3AN2
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice
- CENP-A (H3 varianta) má kratší šroubovici
- vazba na DNA je slabší tj. otevřenější struktura - přístupnější
- … jiný interakční povrch pro specifické interakční partnery …
Yan et al., Nature, 2019
Takizawa et al, Structure, 2020
Yan et al., Nature, 2019
Kixmoeller a spol, Open Biol, 2021
CENP-A(H3) nukleosom a další
CENP proteiny tvoří vnitřní
kinetochoru … kotví vnější
kinetochoru a mikrotubuly
Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén.
(A) Typický chromozom vykazující doménové členění. (B) V kvasinkách
brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí…
(D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3.
Varianty histonů
- CenH3/CENP-A … specificky v centromerách
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
(integrita centromer a telomer)
Billon a Cote, BBA, 2012 Bao, Snapshot-Cell, 2010
Remodelovací komplexy
- ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina)
- „výměna“ histonových dimerů (SWR) nebo „sklouznutí“ (INO80)
SWR komplex specificky zaměňuje (exchange) H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B
- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových
dimerů
Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
- INO80 komplex sliding + zaměňuje H2AZ-H2B dimer zpět za H2A-H2B
Tsabar & Haber, CO in GD, 2013
Oprava poškozené DNA - chromatin
- nukleosomy nejsou na ssDNA … oprava DNA
- pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco
pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit
- NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem)
- při DSB musí být odstraněny nukleosomy pomocí ASF1, CAF-1 a FACT, aby
mohlo dojít k účinné resekci (patrně fyzicky spojené procesy)
- po opravě poškozené DNA jsou nukleosomy uloženy zpět (díky interakci
PCNA s ASF1 a CAF-1 – i zde je H3 K56 acetylován)
- Sgs1/BLM interaguje s CAF-1 a reguluje jeho funkci
- až kompletní reassembly chromatinu signalizuje dokončení opravy!
Sabarinathan et al, Nature, 2016
NER je méně účinný (DNA je méně přístupná) v místech okupovaných
nukleosomy (a transkripčními faktory)
NER oprava - chromatin
Ransom et al, Cell, 2010
- DSB signalizuje/spouští „DNA
damage checkpoint“ - kinasy
- H2A.X varianta je fosforylována
(okolí poškození ~50kb během 15min;
H2A u kvasinek)
- po opravě poškození je γH2A.X
vyměněn FACT komplexem za
nefosforylovaný H2A.X (a H2A)
- nefosforylovaný H2A.X je chráněn
před FACT ribosylací (PARP1)
- H2A.Z varianta je zainkorporována v
okolí poškození (SWR a Chz1) a
pomáhá resekci DNA
- ukončení opravy je signalizováno až
dokončením chromatinového vlákna
DSB poškození – chromatin
RSC remodelovací komplexSNAPSHOT,Cell(144),2011
RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
Chromatinová struktura?
PDB: 6L49
Ekundayo et al, JMB, 2017
pravidelné
uspořádání v
krystalech a za
specifických
podmínek …
Ou a spol, Science, 2017
https://players.brightcove.net/53038991001/Byx2STOH0_default/index.html?videoId=5522198641001
cryoEM jádra
nepravidelné uspořádání
nukleosomů
Ouaspol,Science,2017
Chromatinová vlákna
neuspořádaný řetězec 5-24nm (žádný 30nm coil)
Ohno, Cell, 2019
2 typy sbalení (4) nukleosomů: pyramidální (jako α-šroubovice)
je kompaktnější; kosočtverec (jako β-list plochý) je otevřenější
kombinace Hi-C a
mapování pozic
nukleosomů = Hi-CO
Ohno,Cell,2019
Nukleosomy jsou také více vzdáleny na začátku a konci genových oblastí
(pyramidální α je kompaktnější)
kosočtverec β je otevřenější –
na počátcích a koncích genových
oblastí
α
β
Takahashi, CO in CB, 2019
Kondensované
Mitotické
Chromosomy
kondensiny
cell
cycle
Interfázní chromatinová vlákna
Bednar et al, Mol Cell, 2017
Cutter a Hayest, FEBS Let, 2015
Nukleosom kompaktnější - H1/H5 histony
H1 WHD
doména
Machida a spol, Mol Cell, 2018
Jacobs, Science, 2002
Heterochromatin protein – HP1
obsahuje chromodoménu, která
se váže na 3x-metylovaný lysin
(H3K9me3) – dimer spojuje dva
„metylované“ nukleosomy –
kondenzovanější a rigidnější
struktura chromatinu
dimer
chromodomena
H3K9me3
Heterochromatin – více kompaktní chromatin;
transkripčně neaktivní geny, repetitivní sekvence,
transpozony; oblast centromer, pericentromer a telomer
Konstitutivní a fakultativní heterochromatin
Euchromatin – rozvolněné
uspořádání, obsahuje
transkribující se geny HP1-H3K9me3
Ohno, Cell, 2019
starý vs nový model
strukturní úrovně uspořádání chromatinu
od nukleosomů ke smyčkám …
SMC
Komplexy SMC
SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony
non-SMC podjednotky (2 – 6)
Prokaryota Eukaryota (esenciální)
SMC6 SMC5
- SMC jsou nezbytné pro
vytváření chromatinových
smyček
- podílí se na segregaci,
kondenzaci chromosomů,
chromatinových struktur
(TAD) … a na opravě
DSBs
- složení SMC komplexů
- dlouhá ramena SMC,
dimerizace přes hinge,
ATPase heads
přemostěny ATP a
kleisinovou podjednotkou
- SMC proteiny vytváří
kroužky, které drží DNA
Haering and Jessberger, Exp Cell Biol, 2012
Carlsten et al., TiBS, 2013
kohesin interaguje s mediatorem
- mediator interaguje s GTFs a
RNA polymerázou
(zprostředkuje interakce mezi
GTFs a aktivátory transkripce)
- kohesin interaguje s
mediátorem a napomáhá tvorbě
transkripčních smyček
Bonora et al, CO in GD, 2014
Pugacheva et al., PNAS, 2020
Li et al., Nature, 2020
Kohesin interaguje s CTCF
- CTCF (zinc-finger) „izoluje“ transkripční
faktory a reguluje trankripci
- interakce vymezuje kohesinové smyčky
- utváření vyšších chromatinových struktur
(TAD – topologically associated domains)
Bodnar and Specter, Cell, 2013
Phillips-Cremnis et al, Cell, 2013
Schoborg et al, CMLS, 2014
kohesin se podílí na regulaci „cell-specific“
transkripce a chromatinové struktury (např.
diferenciace kmenových buněk)
TAD – topologicky asoc. domény
Misteli, Cell, 2020
Kompartmenty (A a B) – do jisté míry se překrývají s oblastmi euchromatinu
a heterochromatinu
v interfázi okupují jednotlivé chromosomy určité oblasti jádra (ve formě
chromatinových vláken)
v interfázi okupují jednotlivé chromosomy určité oblasti jádra (ve formě
chromatinových vláken) – v průběhu mitózy chromosomy kondenzují do
typických X-struktur (kvůli snadnější segregaci)
interfáze vs mitoza
Dynamika chromatinuDr. Gorbsky
Kondensace chromatinu = kondensin
Držení sesterských chromatid = kohesin
Losada&Hirano,2005,Gen&Dev
kohesin
- „navlékání“ SMC komplexů na chromatin v průběhu buněčného cyklu
- kohesin obepíná 2 vlákna a drží je až do anafáze – otevře se proteolyticky
Haeringetal,MolCell,2002
Kondensin II vytváří
lineární smyčky (osová
komprese),
kondensin I kondensuje
laterálně
Kschonsak a Haering, BioEssays, 2015
kondensiny
Ganji et al, Science, 2018
Takahashi, CO in CB, 2019
konce molekuly DNA uchyceny
přidán kondenzin + vazba a
hydrolýza ATP – vytvoření
smyčky („loop extrusion)“
in vitro rekonstrukce chromosomů
Shintomi et al, NCB, 2015
HEATDAPI
chromatin
DNA + H3/H4/H2A/H2B … FACT … TopoII … kondensin I (+ATP)
kondensin I a TopoII (FACT chaperon)
postačovaly pro rekonstrukci
mitotických chromatid (z chromatinu
obsahujícího H2A/H2B/H3/H4
nukleosomy)