Ctirad Hofr MUNI SCIlablifeb.org LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Funkční genomika a proteomika Národní centrum pro výzkum biomolekul Kvantitativní metody analýzy interakce protein-protein lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Přehled kvantitativních metod analýzy protein-protein interakcí Vazebná křivka, rovnovážná disociační konstanta, lineární rozsah detektoru. Teorie = základ praxe 1 2 Stanovení vazebné afinity fluorescenčně značených proteinů - fluorescenční anisotropie, microscale thermophoresis, detekce vazby molekul imobilizovaných na povrchu - surface plasmon resonance; studium vazby nemodifikovaných proteinů přímo v roztoku - izotermální titrační kalorimetrie. Fluorescence počtem vede, ale jde to i bez ní 3 Shrnutí praktických výhod a nevýhod kvantitativních metod analýzy interakce protein-protein. Která je nejlepší - srovnání metod lablifeb .org Muni Sci Muni Sci 1 Vazebná křivka 1 isoterma KD disociační konstanta – koncentrace proteinu, při které je právě polovina molekul v komplexu Pro vazbu dvou proteinů A,B a vznik komplexu A.B při konstantní teplotě A+B A.B zapíšeme rovnovážné konstanty asociační KA a disociační KD 𝐾𝐾𝐷𝐷 = 𝐴𝐴 𝐵𝐵 𝐴𝐴𝐴𝐴 % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐾𝐾 ⋅ 100% Jestliže přidáváme postupně protein B k proteinu A, vazebnou křivku lze vyjádřit rovnicí 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace proteinu [B] Závislost míry vazby proteinů A a B na celkové koncentraci přidaného proteinu B KD 𝐾𝐾𝐴𝐴 = 𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴 𝐵𝐵 lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Vazebná křivka 2 odvození rovnice funkce - hyperbola 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace proteinu B Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B Míru vazby vyjádříme poměrem koncentrace komplexu A.B a celkové koncentrace proteinu A násobený 100%. Vazebná křivka je hyperbola s hodnotou disociační konstanty KD ve jmenovateli. Y = %𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 𝐴𝐴𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 ⋅ 100% Po dosazení za A.B a ATOT získáme rovnici pro vazebnou křivku 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 = 𝐾𝐾𝐴𝐴 𝐴𝐴 𝐵𝐵 𝐴𝐴𝑇𝑇𝑂𝑂𝑂𝑂 = 𝐴𝐴 + 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐾𝐾 ⋅ 100% 𝐾𝐾𝐴𝐴 = 1 𝐾𝐾𝐷𝐷 lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Vazebná křivka 3 logaritmus koncentrace = sigmoida 0 25 50 75 100 0.1 1 10 100 1000 %vazby Logaritmus koncentrace proteinu log 10 [B] Závislost míry vazby na logaritmu celkové koncentrace přidaného proteinu B KD KD disociační konstanta – inflexní bod sigmoidy Sklon sigmoidy – míra kooperativity vazby v případě, že se váže více molekul B na jednu molekulu A. Jestliže přidáme k proteinu A protein B v dostatečně širokém rozsahu koncentrací, vazebnou křivkou závislosti míry vazby na logaritmu koncentrace B je sigmoida. % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐷𝐷 ⋅ 100% https://en.wikipedia.org/wiki/H ill_equation_(biochemistry) Jak mění kooperativita vazby tvar sigmoidy? lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Poznejte svůj detektor - lineární rozsah detektoru = přesná kvantitativní měření Celkově má detekční křivka průběh sigmoidy. Pro přesné kvantitativní měření je nezbytné, aby byl přírůstek signálu přímo úměrný přírůstku koncentrace komplexů protein-protein. To je splněno pro lineární rozsah detektoru – oblast detekce, kde zvýšení koncentrace např. dvakrát způsobí zvýšení hodnotu signálu také dvakrát. Oblast pod lineárním rozsahem - jsme blízko minimálnímu detekčnímu limitu = nelineární odezva. Oblast nad lineárním rozsahem – detektor je zahlcen signálem – saturován, velká změna koncentrace způsobí relativně malé a nelineární zvýšení signálu. Vždy zjistit lineární rozsah detektoru. Při kvantitativních měřeních je nezbytné, aby se měřené hodnoty nacházely v lineárním rozsahu detektoru. Signáldetektoru Koncentrace Lineární rozsah detektoru Saturace detektoru Detekční limit 2 Fluorescenční stanovení vazebné afinity z anizotropie Anisotropie fluorescence - princip „Usměrněnost“ emitovaného světla se zvýší po vytvoření komplexu protein-protein; po excitaci lineárně polarizovaným zářením dochází k emisi fluorescence značené molekuly převážně v jednom směru. Prakticky - značíme menší z proteinů. - stačí naznačit 100 µg proteinu v kyvetě. - přidávaný protein není značený. - celková koncentrace přidávaného proteinu je minimálně 10x větší než koncentrace značeného proteinu. Excitace v jednom směru nízká anizotropie vysoká anizotropie „usměrněnost“ čas od excitace po emisi fluorescence t ~ ns Emise fluorescence 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace přidávaného proteinu Složení roztoku v měřící kyvetě lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Anisotropie fluorescence měření polarizátor analyzátor detektor Hodnota anizotropie r je podíl rozdílu IVV - IVH intenzity fluorescence při rovnoběžném (vertikálním) a kolmém (horizontálním) natočení analyzátoru vůči excitačnímu polarizátoru a celkové intenzity fluorescence IVV+2IVH ve 3D – všech třech směrech šíření fluorescence. Prakticky - Přístroj - fluorometr s polarizátorem excitačního světla a otočným polarizátorem = analyzátorem vyzářené fluorescence pro zjištění intenzity v různých směrech. - Potřebujeme ~ 10x vyšší koncentraci než na měření klasické fluorescence – polarizátory propouští 10x měně světla. - Hodnota anisotropie r je bezrozměrná veličina – podíl čísel. 𝑟𝑟 = 𝐼𝐼𝛪𝛪𝛪𝛪−𝐼𝐼⊥ 𝐼𝐼𝛪𝛪𝛪𝛪+2𝐼𝐼⊥ = 𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉−𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉 𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉+2𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉 lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Microscale thermophoresis MST Princip MST - Vytvoříme lokální teplotní gradient - ozáříme vzorek v kapiláře infračerveným laserem. - Vzorek zároveň osvětlujeme excitačním světlem pro fluorofor, kterým je značený menší protein. - Detekujeme pohyb fluorescenčně značených molekul jako změnu fluorescence v mikrooblasti osvětlené IR laserem. - Při konstantní koncentraci fluorescenčně značeného proteinu zvyšujeme koncentraci přidávaného neznačeného proteinu = ligandu. - Sledujeme snížení míry poklesu fluorescence v čase se vzrůstající koncentrací ligandu. Čas ozařování vzorku ~ 20 s https://en.wikipedia.org/wiki/Microscale_thermophoresis Úbytekfluorescence vše navázáno polovina navázána samotný značený protein bound unbound lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Obrázek laskavě poskytl Dr. Josef Houser, CORE FACILITY Biomolecular Interactions and Crystallization http://bic.ceitec.cz/cs Prakticky MST měření protein-protein interakce - Fluorescenčně naznačíme menší protein. - Vytvoříme ředící řadu druhého proteinu = ligandu jeho postupným ředěním 2x. - Smícháme roztoky tak, že koncentrace značeného proteinu je stejná, ale koncentrace ligandu se mění v rozsahu 5 řádů. - Vzorky - 5µL nasajeme do kapilár. - Měříme změnu fluorescence po zapnutí IR laseru. - Vyneseme změnu fluorescence v závislosti na logaritmu koncentrace ligandu. - Z inflexního bodu sigmoidy určíme disociační konstantu vzniku komplexu protein-ligand. Fluorescence Time 1. Initial state – initial fluorescence of sample. 2. Thermophoresis – change in fluorescence due to the thermophoretic motion of molecules. 3. Steady state - local concentration of molecules decreases in the heated region until it reaches a steady-state distribution. 4. Back-diffusion - fluorescence recovery driven by mass diffusion of molecules. IR laser ON Glass capillary IR laser OFF MST – Microscale Thermophoresis 1 2 3 4 připravil Tomáš Janovič Fluorescence Time Analyzing protein-protein interaction with MST FNORM Ligand concentration Measuring MST for ligand serial dilution unbound bound Fcold Fhot KD Evaluating interaction affinity připravil Tomáš Janovič Interakce protein-protein na povrchu Surface plasmon resonance - SPR Evanescentní vlna plazmonů - rezonujících elektronů na povrchu = surface resonance plasmons, které absorbují část světla 50 nm Rezonanční úhel, kdy vznikají plazmony 𝜃𝜃 Zdroj světla - laser Detektor Au Princip Na přechodu mezi sklem a zlatou vrstvou ideálně o tloušťce 50 nm dochází k odrazu světla - laseru. Při rezonančním úhlu 𝜃𝜃 dochází ke zvýšené absorpci, která je zaznamenána detektorem. Vzniká evanescentní (mizející) vlna rezonančních elektronů = plazmonů, která se vzdáleností od povrchu postupně slábne. Dosah evanescentní vlny je přibližně 100 nm do prostoru roztoku. Plazmony jsou velmi citlivé na změny prostředí, ve kterém se pohybují. SPR tak umožňuje detekovat změny díky vazbě proteinů na povrchu zlaté vrstvy. Zlato je pokryto dextranem, na který se imobilizuje jeden interakční protein. Druhý protein je přidáván do pufru, kterým je promýván povrch s imobilizovaným proteinem. Po vzniku komplexu protein-protein na povrchu dochází ke změně rezonančního úhlu 𝜃𝜃, kterou detekujeme. Sledujeme kinetiku vzniku komplexů v reálném čase. Skleněný hranol průtok - Imobilizujeme protein L – ligand na SPR čip. - Nasytíme vazebná místa na povrchu bez imobilizovaného proteinu L. - Promyjeme čip pufrem. - Promýváme čip druhým proteinem A - analyt. - Detekujeme změnu signálu. - Počáteční část křivky ukazuje kinetiku asociace obou proteinů. - Závěrečná část křivky popisuje kinetiku disociace obou proteinů. - Fitovaním vazebných modelů určíme hodnoty rychlostní asociační ka a disociační kd konstanty. Asociační rychlostní konstanta ka popisuje rychlost tvorby komplexů, tj. počet komplexů LA vytvořených za sekundu v jednomolárním roztoku L a A. Jednotka ka M-1s-1 v biologických systémech je hodnota ka mezi 1.103 a 1.107. Disociační rychlostní konstanta kd popisuje stabilitu komplexu, tj. podíl komplexů, které se rozpadnou za sekundu. Jednotka kd je s-1 a v biologických systémech se obvykle pohybuje mezi 1.10-1 a 1.10-6. Když kd 1,10-2s-1 = 0,01 s-1. To znamená, že 1 % komplexů se rozpadne za sekundu. SPR prakticky Asociace Saturace Disociace průtok průtok Čas (s) R–response promytí Saturace KD 𝐾𝐾𝐷𝐷 = 𝑘𝑘𝑑𝑑 𝑘𝑘a www.sprpages.nl Z poměru kd a ka určíme rovnovážnou disociační konstantu KD. d 𝐿𝐿𝐿𝐿 d𝑡𝑡 = 𝑘𝑘𝑎𝑎 ⋅ 𝐿𝐿 ⋅ 𝐴𝐴 − 𝑘𝑘𝑑𝑑 𝐿𝐿𝐿𝐿 d𝑅𝑅 d𝑡𝑡 = −𝑘𝑘𝑑𝑑 ⋅ 𝑅𝑅 ITC – Izotermální titrační kalorimetrie popis interakce měřením reakčního tepla R ∆T http://www.youtube.com/watch?v=cYj5IOELaVI https://youtu.be/o_IpWcWKNXI?t=44 - Princip - Měříme reakční teplo, které se uvolní nebo spotřebuje po přidání proteinu injektorem do roztoku proteinu v měřící cele. Injektor má tvar lodního šroubu, který míchá směs v měřící cele. - Teplota cely se vzorkem je srovnávána s teplotou referenční cely, která obsahuje pouze pufr. - Když dojde ke změně teploty mezi celami, dojde k zahřátí nebo ochlazení cely se vzorkem. Teplo, které je vyměněno pro vyrovnání teplot je zapsáno po každém přídavku proteinu z injektoru. Výsledkem je titrační křivka - sigmoida. - Ze známých molárních koncentrací a změny tepla určíme molární vazebnou entalpii - teplo vazby proteinů. lablifeb .org Muni Sci Muni Sci ITC prakticky Vazebná entalpie ∆H Vazebná konstanta Ka Volná energie ∆G vypočtena z ∆G = -RTlnKa Změna entropie ∆S vypočtena z ∆G = ∆H -T∆S Stechiometrie N -2 -1 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Time (min) µcal/s 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 ∆H = -108 kcal mol -1 ∆S = -317 cal K -1 mol -1 K = 1.63 10 7 N = 0.25 (DNA : protein) Molar ratio [DNA:protein]kcal/molDNA N ∆H Ka - Určíme co nejpřesněji koncentrace proteinů. - Změříme „blank“ titraci - pufr v injektoru, protein v cele při 25°C. - Dáme do injektoru druhý protein s desetkrát vyšší koncentrací, než je první protein v cele. - Změříme titrační křiku. - Odečteme „blank“ titraci od titrační křivky. - Normalizujeme na koncentrace proteinů v cele a injektoru. - Proložíme výslednou sigmoidu vhodným modelem vazby. - Výška křivky udává vazebnou entalpii, sklon odpovídá rovnovážné asociační konstantě a inflexní bod odpovídá molárnímu poměru vazby proteinů. - Z jednoho měření lze získat kompletní termodynamický popis vazby ∆H, ∆S, ∆G, KA a stechiometrii vazby N. lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Srovnání kvantitativních metod 3 3 2 1 10 5 3 4 6 10 8 7 6 8 9 7 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AF MST SPR ITC Spotřeba vzorku Délka přípravy vzorku a měření Přesnost určení KD Uživatelská přívětivost Modifikace proteinu Ano - značení fluoroforem Ano – imobilizace na povrchu Ne – bez značení a modifikace Ano - značení fluoroforem lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Kde se můžete dozvědět více? C7230 Fluorescenční metody ve vědách o životě - cesta od molekuly k buňce C7235 cvičení Teoretická vysvětlení principů fluorescence a praktická výuka aplikace fluorescenčních přístupů Podzimní semestr F9070 Experimentální metody biofyziky Přednášky odborníků a exkurze do výzkumných laboratoří mezinárodně uznávaných společností Podzim semestr Scientific illustration – nový předmět v přípravě Automatické fitování dat v Excel minimalizací součtu druhých mocnin odchylek měřených dat a fitovaných hodnot za použití doplňku Řešitel (Solver) si můžete vyzkoušet v souboru Videonávod, jak aktivovat doplněk Řešitel (Solver) v programu Excel je v souboru Návod vznikl na základě videa - autor Karl Zuvela https://youtu.be/4jpoCGWmfeM Vyzkoušet, jak se mění tvar vazebné křivky v závislosti na KD si můžete v souboru Prakticky – fitování vazebné křivky pro chytré hlavy Automat_KD_fit.xlsx KD_vliv_na_tvar_krivky.xlsx Resitel_Solver_ON.mp4 když ručně změníte hodnotu KD na řádku 16. http://www.lablifeb.org/courses/