Příprava vzorku pro proteomiku zdola1 CG090 Metody v proteomice Příprava vzorku pro proteomiku zdola Gabriela Lochmanová, Ph.D. Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola2 Proteomika zdola • Peptidy vhodné velikosti pro analýzu běžně dostupnou instrumentací • Identifikace a kvantifikace tisíce proteinů z jednoho vzorku (bez potřeby předchozí znalosti o složení vzorku či dostupnosti protilátek) • Dostupné „open-source“ a komerční programy • Umožňuje: ➢ identifikovat peptidy a z nich odvodit identifikaci proteinů ➢ identifikovat a lokalizovat posttranslační modifikace (PTM) ➢ určit relativní zastoupení peptidů mezi vzorky Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola3 Proteomika zdola • Vstupní materiál: rozmanité typy vzorků ➢ purifikované proteiny ➢ buňky ➢ tkáně ➢ biologické tekutiny Vývoj metod a spotřebního materiálu pro přípravu vzorku • Současný trend: ➢ přístupy v roztoku – časově výhodné, laboratorně jednodušší, minimalizované ztráty vzorku ➢ přístupy bez precipitace – alternativní metody využívané pro odstranění detergentů a dalších kontaminant (suspension trapping, paramagnetické kuličky) Tradiční přečištění vzorku na reverzně-fázové chromatografii lze využít pro odsolení, ale ne pro odstranění detergentů či polymerů x Nové přístupy využívající magnetické kuličky umožňují odstranění detergentů, polymerů i solí pI MW Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola4 Proteomika zdola − Obecný postup • Sled kroků zahrnující štěpení proteinu na peptidy doprovázené odstraněním kontaminant ze vzorku • Výběr postupu se odvíjí od komplexity vzorku a cíle experimentu. Komplexita vzorku − počet proteinů − dynamický rozsah koncentrace proteinů Homogenizace / Lýze Kvantifikace proteinu Redukce a alkylace Enzymatické štěpení Přečištění vzorku Frakcionace Frakcionace Přečištění vzorku Kvantifikace peptidů Hmotnostní spektrometrie Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola5 Homogenizace / Lýze • Metody založené na reagenciích • rychlé, jemné, účinné, reprodukovatelné • extrakce celkového proteinu nebo proteinů subcelulární frakce • komponenty nekompatibilní s MS musí být následně odstraněny • vhodné pro buněčné kultury, ale nemusí být účinné pro některé tkáně • Mechanické přístupy • lýze šiřoké škály vstupního materiálu • vysoká lyzační účinnost • vyžaduje instrumentaci • omezená reprodukovatelnost • denaturace a agregace proteinů kvůli lokálnímu přehřátí • rozrušení buněk a subcelulárních komponent v různých časech Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola6 Homogenizace / Lýze Adaptive cavitation Technology ACT − Rychlé změny tlaku v kapalném vzorku během sonikace − Vznik bublin při lokálním poklesu tlaku − Praskání bublin při dosažení kritické velikosti 5 mikrolitry až 2 mililitry vzorku (v závislosti na adaptéru) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola7 Proteomika zdola − Kvantifikace proteinů / peptidů • Kvantifikace proteinů − výpočet množství enzymu potřebného pro štěpení proteinů • Kvantifikace peptidů −kontrola výtěžku po štěpení − určení objemu vzorku pro nástřik do LC-MS/MS − zásadní pro kvantifikační analýzy, kde je třeba přesně nastavit ekvivalentní množství peptidů mezi porovnávanými vzorky • Kolorimetrická stanovení často interferují s chemikáliemi přítomnými v pufrech potřebných pro lýzi, jako jsou detergenty nebo redukční činidla např. Bradford – nekompatilní s SDS; BCA – nekompatibilní s DTT, β-ME, EDTA. • Fluorimetrické metody − Proteiny obsahují tři různé aromatické aminokyseliny obsahující benzenové, fenolové či indolové jádro. Každá z těchto skupin může být excitována UV světlem. Fluorescence tryptofanu − vysoce citlivá k mikroprostředí, např. polaritě solventu − zhášena mnoha chemikáliemi přítomnými v pufrech, např. detergenty − závislá na teplotě a pH Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola8 Stanovení koncentrace proteinu / peptidu na základě fluorescence tryptofanu (WF) • většina detergentů v koncentraci používaných v solubilizačních pufrech zháší fluorescenci • Kvantifikace Trp – nízká interakce detergentů s proteiny v pufru obsahujícím 8 M močovinu, indolová skupina Trp je volně exponována do roztoku; Emmax = 350 nm • Vhodné pro vysoce komplexní vzorky, méně pro proteinové / peptidové frakce Emisní spektra celobuněčného lyzátu (6, 12, a 18 μg celkového proteinu) a čistého tryptofanu (0.05, 0.1, a 0.15 μg) ve 2 mL 8 M močoviny a 10 mM Tris-HCl, pH 7.8. Zhášecí efekt detergentů a DTT. Koncentrace detergentů odpovídá koncentraci v 2 μL roztoku přidaného do 2 mL 8 M močoviny. Wisniewski et al., 2015, 87(8):4110-6 • pracovní koncentrace 0.05 - 25.0 mg/mL Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola9 Stanovení koncentrace proteinu / peptidu pomocí MicroBCA kitu • kolorimetrická detekce a kvantifikace celkového proteinu / peptidu • vhodné i pro méně komplexní vzorky • pracovní koncentrace 0.5-20.0 µg/mL • kompatibilní s detergenty • nekompatibilní s reduktanty a chelatanty (DTT, β-ME, EDTA…) Wisniewski et al., 2015, 87(8):4110-6 • Proteinový roztok je smíchán v alkalickém prostředí s ionty Cu2+, které jsou po chelataci peptidickou vazbou redukovány na Cu1+. Cu1+ jsou následně chelatovány 2 molekulami BCA za vzniku fialového produktu, který absorbuje při 562nm. Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola10 WF vs. MicroBCA Wisniewski et al., 2015, 87(8):4110-6 • Obě metody vysoce citlivé se srovnatelnou reprodukovatelností pro stanovení proteinu v lyzátu • WF lepší reprodukovatelnost při stanovení peptidů, zejména v nižších koncentracích Studijním ateriály Denaturace Redukce Alkylace 11 Redukce a alkylace proteinů • Disulfidické můstky v proteinu jsou ireverzibilně rozrušeny. • Tato chemická modifikace zlepšuje identifikaci proteinů s vysokým obsahem disulfidických můstků, ale také vyšší výtěžek peptidů a vyšší sekvenční pokrytí. • Nekompletní redukce / alkylace může ovlivnit kvalitativní i kvantitativní výsledky. • Nechtěná alkylace “over-alkylation” = alkylace nethiolových skupin N-terminální ak > k. asparagová > k. glutamová > histidin > asparagin > lysin > tyrosin DTT− Dithiothreitol TCEP − tris-(2-carboxyethyl)-phosphine BME − β-mercaptoethanol R A Příprava vzorku pro proteomiku zdola IAA − iodoacetamide IAC − iodoacetic acid AA − acrylamide CAA − chloroacetamide Protein s disulfidickými můstky Redukce rozruší disulfické můstky a umožní rozvolnění struktury Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola12 Promega datasheet Redukce a alkylace proteinů Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola13 TPCK Trypsin: štěpí z karboxy-konce K a R; blokovaná autolýza SOLu-Trypsin: dodáván v roztoku, stabilní 1 měsíc při 4°C SOLu-Trypsin Dimethylated: dodáván v roztoku, stabilní 1 měsíc při 4°C; blokovaná autolýza Rapid Digestion Trypsin: štěpení 1 h při 70°C Platinum Trypsin: bez nespecifické proteolytické aktivity; rezistentní vůči autolýze LysC: štěpí z karboxy-konce K Glu-C (V-8 Protease): štěpí z karboxy-konce E (v uhličitanovém či acetátovém pufru) štěpení může probíhat za E i D (ve fosfátovém pufru) Asp-N: štěpí z N-konce D Chymotrypsin: štěpí z karboxy-konce aromatických kyselin - Y, F, W a L. Thermolysin: štěpí z N-konce L, F, V, I, A, M při 65–85°C ProAlanase: štěpí z karboxy-konce P a A Enzymatické štěpení proteinů Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola14 Enzymatické štěpení proteinů – alternativní proteázy Anal. Chem. 2020, 92, 9523−9527 Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola15 Anal. Chem. 2020, 92, 9523−9527 Sekvenční štěpení – trypsin – v proteomice proteáza první volby – specifické studie mohou využít sekvenčního štěpení alternativní proteázy s trypsinem – specifické studie mohou využít alternativní proteázy Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola16 Proteomika zdola− Postup pro jednoduché proteinové vzorky Purifikovaný protein Frakce z HPLC Subcelulární frakce Vodný roztok MS-kompatibilní roztok Kvantifikace peptidu Kvantifikace proteinu Redukce a alkylace Enzymatické štěpení Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola17 Proteomika zdola − Postup pro štěpení v gelu Buňky Tkáně Biologické tekutiny Solubilizační pufr obsahující SDS/DTT Redukce a alkylace Hydratace Enzymatické štěpení v gelu Extrakce peptidůPromytí gelu Dehydratace • 1-D nebo 2-D gel – MS-kompatibilní vizualizace • Vstup enzymu do gelu je usnadněn dehydratací acetonitrilem a následnou rehydratací pufrem s proteázou (difúze). • Menší kousky gelu – vyšší účinnost štěpení v gelu • Relativně vysoká koncentrace enzymu • Kyselá extrakce peptidů (50% acetonitril/2.5% k. mravenčí) v kombinaci se sonikací. • Výhoda: kontaminanty (např. detergenty, soli) odstraněny již během elektroforézy • Nevýhoda: omezená účinnost vzhledem k nízké přístupnosti proteázy do gelu a málo efektivní extrakce naštěpených peptidů z gelové matrice. Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola18 Proteomika zdola − Postup pro komplexní vzorky Buňky Tkáně Biologické tekutiny Solubilizační roztok obsahující detergenty, chaotropní činidla, soli Kvantifikace peptidu Enzymatické štěpení Kvantifikace proteinu Redukce a alkylace Přečištění proteinu (odstranění kontaminant nekompatibilních s MS) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola19 Solubilizace vysoce komplexních vzorků a přečištění Homogenizace v SDT pufru 4% SDS, 0.1M DTT, 0.1M Tris-HCl pH 7.6 Homogenizace / Lýze • Přečištění a enzymatické štěpení: Filter-Aided Sample Preparation (FASP) Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) Suspension Trapping (S-Trap) • Proteinový prášek / Buňky přeneseny do zkumavky s horkým SDT pufrem. • Homogenizace podpořena v Bioruptoru, fragmentace DNA. • Kompletní solubilizace proteinů zajištěna inkubací při 95°C, 2h. • Dodatečné přečištění: Ethylacetate extraction (EE) Kritická micelární koncentrace (CMC) c < CMC – detergenty se vyskytují jako monomery c > CMC – molekuly detergentu jsou organizovány do micel, které zajišťují solubilizaci. Vzhledem k velikosti, micely SDS a směsné micely s SDS nemůžou být separovány od solubilizovaných proteinů ultrafiltrací. V metodě FASP zajišťuje koncentrovaný roztok močoviny disociaci micel. Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola20 Role SDS v proteomických přístupech • Potlačení enzymové aktivity během štěpení • Ovlivnění reverzně-fázové kapalinové chromatografie a její povrchové aktivity − SDS naruší separaci peptidů (posun retenčních časů) • Potlačení ionizace (MS spektra SDS dominují vzhledem k vysoké schopnosti ionizace, vysoké koncentraci a tvorbě signálů aduktů SDS-peptidy). • Usnadnění solubilizace • Odstranění SDS (precipitace proteinu, kolonové přístupy, dialýza, …). • Přítomnost SDS napomáhá štěpení membránových proteinů Možná řešení: • MS-kompatibilní alternativy k SDS (např. štěpitelné surfaktanty: ProteaseMAX, RapiGest, PPS Silent Surfactant, octyl β-D-glucopyranosid, n-dodecyl β-D-maltosid, and digitonin) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola21 Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola22 Přečištění proteinu: Filter-Aided Sample Preparation (FASP) MWCO „molecular weight cut-off“ Molekula o dané velikosti (Da) zadržena membránou s 90% účinností ultrafiltr 8M močovina IAA/8M močovina močovina SDS DTT Proteiny v SDT pufru Centrifugace Uhličitan amonný močovina IAA Centrifugace Trypsin Centrifugace Nukleové kyseliny Proteiny Vysokomolekulární látky Inkubace Centrifugace Purifikované peptidy Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) • Vynikající efekt pro vzorky o koncentraci proteinů 25 až 100 μg Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola23 • multienzyme digestion (MED) FASP (Anal. Chem. 2012, 84, 2631−2637) − sekvenční štěpení proteinu více enzymy − vyšší počet proteinových identifikací a vyšší pokrytí sekvence − vyšší počet identifikovaných fosforylovaných míst Anal. Chem. 2012, 84, 2631−2637 Přečištění proteinu: varianty FASP Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola24 • enhanced FASP (eFASP) (J. Proteome Res. 2014, 13, 1885 − 1895) − pasivace povrchu membrány 5% TWEEN-20 a využití surfaktantu (0.2% k. deoxycholová) během štěpení za účelem zvýšení výtěžku peptidů. • 96-jamkový formát pro zpracování „high-throughput“ − destičky s 10 MWCO membránou; nevýhoda: nízký přenos kapaliny během centrifugace (Proteomics 2013, 13, 2980–2983) − MStern-blot (MStern) – destičky s polyvinyliden fluoridovou membránou (PVDF) s velkými póry, která efektivně adsorbuje proteiny; rychlý přenos kapaliny přes membránu pomocí vakua. (Mol Cel Proteomics 2015 Oct;14(10):2814-23) − polyethersulfonová (PES) filtrační membrána umožňuje využití 10% isopropanolu (IPA) jako smáčecího činidla, což vede k 50% redukci času pro výměnu pufru. IPA redukuje povrchové napětí mezi vodnou vrstvou a membránou. Kvůli přítomnému alkoholu dochází ke snížení CMC detergentů, ta je přesto dále ještě snížena přídavkem močoviny. (PLoS ONE 2017, 12(7): e0175967) J. Proteome Res. 2014, 13, 1885 − 1895 Mol Cel Proteomics 2015 Oct;14(10):2814-23 Přečištění proteinu: varianty FASP Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola25 Přečištění peptidů: Ethylacetátová extrakce (EE) Curr Protoc Protein Sci. 2010 February ; CHAPTER: Unit–16.12. hustota (g/mL) EE 0.902 voda 0.998 • Ethylacetát − vysoce volatilní − málo rozpustný ve vodě − účinné rozpouštědlo pro většinu detergentů (octylglucosid, SDS, Triton X-100, NP-40….) EE saturovaný vodou • EE extrakce − dvoucestný proces: přechod hydrofobních molekul do organické fáze z vodné fáze, a přechod hydrofilních molekul z organické fáze do vodné fáze − extrakční rozpouštědlo musí být vysoce čisté − skleněné zkumavky a pipety omyté v kyselině pro uchování EE − polypropylenové či polyethylenové zkumavky a pipety mohou být použity pouze krátkodobě pro extrakci − pětinásobný objem EE oproti objemu peptidového vzorku − selektivní ztráta peptidů (např. větší peptidy) Vortex Centrifugace Odstranění horní vrstvy Peptidy se stopami SDS Purifikované peptidy EE SDS Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola26 Alternativní metody pro štěpení / přečištění „Protein Aggregation Capture (PAC)“ na mikročásticích s různým chemickým povrchem – mechanizmus využívající nespecifickou imobilizaci precipitovaných a agregovaných proteinů na částicích s různým povrchem (Mol Cell Proteomics 18: 1027–1035, 2019) Nature protocols JANUARY 2019 | 68 – 85 EtOH 50% EtOH 80% Trypsin/AB Shluknutí kuliček (Mol Cell Proteomics 18: 1027–1035, 2019) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola27 Alternativní metody pro štěpení / přečištění Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample-Preparation (SP3) – přístup založený na využití paramagnetických kuliček – využívá mechanizmus PAC pro výměnu nebo odstranění kontaminant (např. detergenty, chaotropní činidla, soli, pufry, kyseliny, rozpouštědla) – neselektivní vazba proteinů a promývací kroky, které umožňují využití solvatační vrstvy tvořené rozhraním ethanol-voda na povrchu paramagnetických kuliček – eluce purifikovaných proteinů ve vodném prostředí (Nature protocols JANUARY 2019 | 68 – 85) PROTEINOVÝ LYZÁT 0.1 mg - 500 mg CONTAMINANTY Detergenty 0-20% Chaotropní činidla 0-8M Soli 0-1M Rozpouštědla 0-50% ELUOVANÉ PEPTIDY • polystyrenové jádro polymerace volných radikálů styrenu a kyselého monomeru • Vrstva magnetitu • Karboxalovaný povrch polymeru povrch je modifikován za účelem potlačení nespecifických vazeb proteinů SeraMag beads Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola28 SP3 vs. FASP Front plant Sci 2021 Mar 10;12:635550 Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola29 Přečištění peptidů: SP2 J Proteome Res. 2019 April 05; 18(4): 1644–1656. RP-LC C18 − účinný pro odstranění solí a zakoncentrování peptidů − dostupný v různorodých provedeních (např. Stage-Tips, Sep-Pak Cartridges, Micro SpinColumns) − nicméně, C18 neodstraní polymerní sloučeniny jako polyethylen glycol (PEG) ani běžné detergenty, (např. NP-40, SDS, Triton X), spíše dojde k jejich zakoncentrování. SP2 − nižší vazebná kapacita pro peptidy než pro proteiny: 50 ng jednoduché peptidové směsi/μg částic, 200 ng komplexní peptidové směsi/μg částic X 100 μg proteinové směsi/μg částic − vhodná metoda pro odstranění široké škály kontaminant; (nevhodná např. pro odstranění Tris) − pro dlouhé, hydrofobní peptidy či peptidy s negativní nábojem je SP2 reprodukovatelnější než C18 Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola30 Magnetické stojánky Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola31 Alternativní metody pro štěpení / přečištění Suspension trapping (STrap) – momentální tvorba jemné suspenze proteinů solubilizovaných v SDS, která je zachycena skleněným filtrem – agregace suspenze minimalizovaná přídavkem směsi protein–SDS do ethanolického roztoku v neutrálním pH – monomery SDS jsou solubilní v ethanolickém roztoku a filtrovány společně s ostatními kontaminantami • Lýze a solubilizace v 5% SDS • Denaturace proteinu okyselením na pH < 1 a následně přídavkem vysoké koncentrace ethanolu • Tyto tři stupně denaturace zajišťují kompletní inaktivaci enzymů jako jsou proteázy a fosfatázy • redukce a alkylace může být provedena v 5% SDS nebo až na koloně po denaturaci a záchytu proteinové směsi • denaturované, nenaštěpené proteiny jsou vázány na S-Trap pomocí centrifugace či vakua • Mnohočetné slabé interakce zadržují nenaštěpené proteiny uvnitř pórů upravené siliky S-Trap • Zachycené proteiny se vyznačují maximální povrchovou plochou, která umožňuje promytí od kontaminant během několika minut: detergenty, PEG, glycerol, soli, Laemmli pufr, etc. Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola32 Solubilizace vysoce komplexních vzorků pro obohacení PTM Homogenizace v pufru s močovinou 9M močovina, 20mM HEPES pH 8.0 Přečištění: reversed-phase Solid-Phase Extraction (SPE; Sep-Pak® C18 Cartridges) Vodíková vazba mezi močovinou a peptidickou vazbou umožňuje vstup vody a podílí se na rozvolnění struktury a denaturaci proteinu. Zhang et al., 2017, Phys. Chem. Chem. Phys., 19, 32007-32015 10mL močovina / HEPES Počet buněk ~1×10E8 Promytí PBS Trypsin Enzymatické štěpení Sonikace Vyředění (koncentrace močoviny max 2M)Centrifugace Eluce: 0.1%TFA/40% ACN Okyselení digestu: pH ˂3 Purifikované peptidy Redukce a alkylace Lyofilizace (Odstranění TFA) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola33 Obohacení PTM Lyofilizované peptidy IAP pufr Imunoafinitní purifikace (IAP) pH~7.0 Anti-PTM Ab Incubace 2h, 4°C Centrifugace Promytí Eluce 0.15% TFA Centrifugace Promytí Přečištění C18 SpinTip PTMScan® Technology (Cell Signaling Technology) – obohacení posttranslačně modifikovaných peptidů imunoprecipitací s využitím specické protilátky vázané na kuličky, s návazností na kvantitativní analýzu pomocí LC-MS/MS. fosforylace (PhosphoScan®) ubiquitinace (UbiScan®) acetylace (AcetylScan®) methylace (MethylScan®) protein A agarózové kuličky 10 - 20 mg peptidů měření konc. pept. microBCA assay Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola34 Fosfoproteomika − převážně založena na proteomice zdola (bottom-up) − fosforylace probíhá na jednom či více místech a může se vyskytovat společně s dalšími PTM, čímž jsou definovány tzv. proteoformy. − techniky pro analýzu fosfo-serinových/threoninových míst (pSer/pThr) se významně zdokonalily, ale analýza tyrosinových (pTyr) míst je stále náročná kvůli minoritnímu zastoupení (řádově nižší výskyt oproti pSer/pThr) − fosfopeptidy mají tendenci k nízké ionizační účinnosti vzhledem k (i) fosfátové skupině, která snadno ztrácí proton a nese negativní náboj (ii) pozadí pocházejícího z nadbytku přítomných nefosforylovaných peptidů − fosfopeptidy jsou nízkoabundantní relativně vůči svým nefosforylovaným protějškům Analytica Chimica Acta 1129 (2020) 158e180 Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola35 Fosfoproteomika Afinitní obohacení fosfopeptidů − selektivní vazba negativně nabitých fosfátových skupin peptidů na ion kovu či oxid kovu nebo s využitím Ab − Eluce z IMAC či MOAC uvolněním negativně nabitého fosfátu alkalickým pufrem − IMAC vede k lepší detekci multi-p-peptidů, zatímco obohacení na TiO2 vede k vyššímu počtu identifikací mono-p-peptidů kvůli obtížnější disociaci (nekompletní eluci) multi-p-peptidů Analytica Chimica Acta 1129 (2020) 158e180 Fe3+ Ga3+ TiO2 ZrO2 In2O3 − Obohacení pomocí TiO2: vyšší selektivita a specifita, robustnost, amfoterní iontoměničový charakter, tolerance vůči mnoha reagenciím (stabilní v širokém rozmezí pH) − Různá konfigurace MOAC-TiO2: spin kolonky, analytické kolony, miniaturní kolony, nanočástice, ma, … − pTyr – minoritní frakce p-proteomu; pro selektivní obohacení využívány anti-Tyr Ab (nízká reprodukovatelnost, nízká citlivost, omezená dostupnost, omezená dostupnost velkého množství vstupního materiálu, vysoká cena) Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola36 Obohacení fosfopeptidů High-Select ™ TiO2 Phosphopeptide Enrichment Kit – sférická porózní forma TiO2, optimalizované pufry, spin kolonky – poskytuje efektivní obohacení a navýšení počtu identifikovaných fosfopeptidů s minimalizací nespecifických vazeb – výtěžek fosfopeptidů je obvykle ~1-3% výchozího množství peptidů – vstupní materiál: přečištěné lyofilizované peptidy (bez detergentů a solí) pH>10 0.5 – 3.0 mg peptidů solubilizované v k. mléčné Centrifugace Promytí Ekvilibrovaná spin kolonka spin kolonka s navázanými fosfopeptidy Eluce NH4OH pH<3 Odpaření elučního pufru Okyselení Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola37 Enzymatické štěpení 10 20 30 40 50 MGKKQNKKKV EEVLEEEEEE YVVEKVLDRR VVKGKVEYLL KWKGFSDEDN 60 70 80 90 100 TWEPEENLDC PDLIAEFLQS QKTAHETDKS EGGKRKADSD SEDKGEESKP 110 120 130 140 150 KKKKEESEKP RGFARGLEPE RIIGATDSSG ELMFLMKWKN SDEADLVPAK 160 170 180 EANVKCPQVV ISFYEERLTW HSYPSEDDDK KDDKN 10 20 30 40 50 MGKKQNKKKV EEVLEEEEEE YVVEKVLDRR VVKGKVEYLL KWKGFSDEDN 60 70 80 90 100 TWEPEENLDC PDLIAEFLQS QKTAHETDKS EGGKRKADSD SEDKGEESKP 110 120 130 140 150 KKKKEESEKP RGFARGLEPE RIIGATDSSG ELMFLMKWKN SDEADLVPAK 160 170 180 EANVKCPQVV ISFYEERLTW HSYPSEDDDK KDDKN 10 20 30 40 50 MGKKQNKKKV EEVLEEEEEE YVVEKVLDRR VVKGKVEYLL KWKGFSDEDN 60 70 80 90 100 TWEPEENLDC PDLIAEFLQS QKTAHETDKS EGGKRKADSD SEDKGEESKP 110 120 130 140 150 KKKKEESEKP RGFARGLEPE RIIGATDSSG ELMFLMKWKN SDEADLVPAK 160 170 180 EANVKCPQVV ISFYEERLTW HSYPSEDDDK KDDKN Characterizace obohacených (nízkoabundantních) proteinů Cílový protein Identifikace / Kvantifikace • PTM na cílovém proteinu • Interakčních partnerů 10 20 30 40 50 MSGRGKGGKG LGKGGAKRHR KVLRDNIQGI TKPAIRRLAR RGGVKRISGL 60 70 80 90 100 IYEETRGVLK VFLENVIRDA VTYTEHAKRK TVTAMDVVYA LKRQGRTLYG FGG Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola38 varianta I varianta II Characterizace obohacených sekvenčních variant varianta I varianta II varianta I varianta II Enzymatické štěpení Enzymatické štěpení Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola39 Praktický kurz C8302 III. Obohacení fosfopeptidů II. Digesce a přečištění na SP3 I. Digesce v gelu Studijním ateriály Příprava vzorku pro proteomiku zdola40 Vybrané obrázky byly připraveny v BioRender.com. Děkuji za pozornost! Gabriela Lochmanová gabriela.lochmanova@ceitec.muni.cz Studijním ateriály