CG090 – Metody v proteomice Analýza protein-proteinových interakcí doc. Jan Paleček Laboratoř Strukturních proteinů eukaryotických chromosomů, NCBR PřF jpalecek@sci.muni.cz rozšiřující přednáška: Struktura a funkce proteinových komplexů (CG030) Informační zdroje Golemis a Adams: Protein-protein interactions … … z praxe, nejnovější metody z odborné literatury … Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ... http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1 Metody analýzy proteinových komplexů - ultracentrifugace, gelová filtrace, - TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza - ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace … - cross-linking MS, (cryo) elektronová mikroskopie … Metody analýzy protein-proteinových interakcí - martix/beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: painting, H/D-exchange … - ko-krystalizace, NMR analýza … - in silico metody (docking) - kvantitativní: SPR, ITC … … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) vúvodnípřednášce„Strukturaafunkce proteinovýchkomplexů“ mapováníbinárníchinterakcí hybridní! Metody analýzy protein-proteinových interakcí - matrix/beads-based: - ko-imunoprecipitace - ko-purifikace – gelová filtrace - pull-down - analýza proteinových domén - analýza interakčních povrchů - použití peptidů - mapování interakcí - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: painting, H/D-exchange … - ko-krystalizace, NMR analýza … - in silico metody (docking) - kvantitativní: SPR, ITC … … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) mapováníbinárníchinterakcí Tagy (a protilátky): Myc, FLAG, V5, S-tag, Streptactin (biotin-streptavidin), < Western (anti-GST) Podobný princip jako při ko-purifikaci/precipitaci Charakterizace interakcí - domény Sergeant et al, MCB, 2005 Doyle et al, Mol Cell, 2010 Ubírat či přidávat SMC5= Spr18 MS spektrum celého proteinu (normální pokrytí sekvence) MS spektrum precipitátu (obohacená interakční část) P. Reichman (Diplomová práce) Další MS metody dále … Charakterizace interakcí – detailní mapování 1 2 3 4 1 2 3 4 Podobně jako při ELISA jamky jsou potažené streptavidinem peptidy se přes biotin ukotví Lze mapovat epitop pro protilátky (vazbu) Peptidy jsou na N-konci biotinylované Peptidové mapování Cortone et al, PLoS Genet, 2018 na sklíčku mikrotitrační miska (potažená streptavidinem) peptidy se navážou přes biotin Stačí mnohem méně proteinu Guerineau et al, PLoS One, 2012 Peptidové mapování Analýza Nse3-Nse4 interakce Délka: 25 AMK Posuv: 4 AMK Knihovna: 18 peptidů Nse4 peptidy 90 AMK Charakterizace interakcí – „alanin scan“ EID2 peptidy (paralog Nse4) Délka: 25 AMK Posuv: mutace po 1 AMK Knihovna: 20 peptidů A Guerineau et al, PLoS One, 2012 Charakterizace interakcí – „alanin scan“ EID2 peptidy (paralog Nse4) Délka: 25 AMK Posuv: mutace po 1 AMK Knihovna: 20 peptidů A Guerineau et al, PLoS One, 2012 zmapována vazba šroubovice mutace (disrupce) ukáží, které AMK jsou důležité pro interakce (nebo strukturu) Jak je šroubovice orientována? Mohou mutace vylepšit interakčních schopnosti? Viz dále … - maleimidy reagují se sulfhydrylovou skupinou Cys (kovalentní vazba) - ve většíně proteinů je málo cysteinů – lze využít pro cílený crosslink - cílené mutace na Cys - na SDS-PAGE lze detekovat XL Mapování interakcí - crosslinking více o XL ještě dále v MS metodách protein 1 crosslink protein 1 s proteinem 2 intenzita koreluje se vzdáleností Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém - domény - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy - fold - BiFC, DHFR - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: painting, H/D-exchange … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Uetz and Finley, 2005 Traven et al.: EMBO Report, 2006 Při studiu mechanismů transkripce v kvasinkách S. cerevisiae byl vyvinut tzv. Y2H Na spínaní/regulaci metabolismu galaktosy se podílí transkripční faktor Gal4p – váže specifické sekvence v UAS genů (Gal enzymů) a aktivuje jejich transkripci Dvou-hybridní systémy (kvasinkové) Paleček: Biologie kvasinek (C9045), Str.& Fun. Prot komplexů (CG030) Gal4p Transkripční komplex Luban & Goff, CO Biotech, 1995 DB DB AD AD DB AD DB AD Y2H - DNA-vazebná doména (DB) bez aktivační domény (AD) není schopna aktivace transkripce Je možné propojit domény jakýmkoli linkerem a transkripci reaktivovat Gal4p DB AD DB AD systém vhodný i pro pull-down Y2H myc Tag transformace plasmidů do kvasinky plasmid (TRP1) plasmid (LEU2) MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA) - Testuje se schopnost růstu kvasinek na médiu bez histidinu (nebo adeninu – červená/bílá) - lze použít i pro hledání proteinových interakčních partnerů (screen knihovny) Kvasinkový kmen kvantitativní auxotrofie (media bez …) FACSorting rezistence (media s AbA) Reportérové geny Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012 His3 His3 Nse3 Nse4 K. Bednarova (Diplomová práce) aminotriazol (3-AT) inhibuje His3 enzym His3 His3 “alanin scan” konservovaných AMK ukázal hydrofobní kapsu “alanin scan” konzervovaných AMK ukázal hydrofobní kapsu na povrchu Nse3 … … do níž se váže hydrofobní šroubovice Nse4 proteinu Pomocí in silico (MD) analýzy byl vytvořen model dimeru Nse3-Nse4 (docking) Reversní systém (Y2H) - při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374 je vhodnější pozitivní selekce (screenovat na rostoucí kvasinky) Split-hybrid systém represor bez represoru Uetz et al, Nature, 2000 Y X DBD AD Mat a buňky 8x12 jamek (96 na misku) Všechny ORF Mat α buňky Kvasinkový, lidský … „INTERACTOM“ High-throughput – testovány knihovny 6000x6000 proteinů (kombinace pomocí párování místo transformace) Analýza vazby protein-RNA (Y3H) SenGupta et al, PNAS, 1996 Tři hybridní/fůzní konstrukty: 1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein) 2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2 sekvence 3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR) Vazba ligand-receptor (Y3H) FK506 Licitra & Liu, PNAS, 1996 dexamethasone glucocorticoid receptor - FKBP12 Tři fúzní (hybridní) makromolekuly (2x protein a 1x nízkomolekulární ligand) Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém - domény - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy - fold - BiFC, DHFR - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: painting, H/D-exchange … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) CytoTrap 2-hybridní systém Kvasinkový cdc25-2 ts (teplotně sensitivní) mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti - jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě) Broder et al, Cur Biol, 1998 Boderetal,ArchBiochBiphys(2012) - analyzovaný Aga2-hybridní protein je umístěn na povrchu buňky (kvasinkové, bakteriální/fág) – partner značen flurescenčně/biotin - čím vyšší afinita tím větší pravděpodobnost „zachycení“ – lze vyselektovat nejlepší vazebné sekvence („mutace“) množením buněk se nabohatí „nejlepší“ sekvence - opakovaný sorting YSD „yeast surface display“ – cílená in vitro evoluce selekce na kuličkách selekce fluorescenční Currin et al, CSR, 2015 cílená in vitro evoluce takto lze modifikovat interakční schopnosti proteinů a nalézt motivy s vyšší afinitou … Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: - transkripční 2-hybridní systém – propojení domén - reverzni systém – analýza PPI - více-hybridní systémy - inhibice PPI - membránový systém - pathway - komplementační systémy – propojení fold domény - BiFC, DHFR - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: painting, H/D-exchange … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) Protein-fragment complementation Shekhat & Ghosh, CO in ChB, 2011 Bimolecular fluorescence complementation - BiFC Kodama & Hu, Biotechniques, 2012 Bimolecular fluorescence complementation - BiFC Propojuje se zpět fold/struktura nikoli 2 domény jako u Y2H (lokalizace proteinů do tkání, buněčných kompartmentů …) Pekarova et al, Plant J., 2011 Bruckner et al, IJMS, 2009 Přehled kvasinkových PPI biotechnologií Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - proximity-based - FRET - PLA - MS-based: painting, H/D-exchange … - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) FRET (Forster/fluorescence resonance energy transfer) - fluorescence prvního (CFP) proteinu o vhodné vlnové délce excituje druhý protein - (pokud je dostatečně blízko) - druhý protein emituje (YFP, fluorescence) záření detekované v mikroskopu hybridní, ale nikoli doménový či komplementační Ko-lokalizace a proximity ligation assayWeibrechtetal,ERProt,2010 - kolokalizace dvou proteinů v buňce (mikroskop) neznamená interakci, ale … PLA: protilátky obsahují oligonukleotidy komplementární k olignukleotidům schopným tvořit kruhovou DNA – pouze pokud jsou protilátky blízko sebe (<16nm) - po ligaci může polymeráza obíhat po kružnici Metody analýzy protein-proteinových interakcí - beads-based: pull-down (in vitro), coIP … - hybridní: Y2H (kvasinkový 2-hybridní), BiFC … - proximity-based: FRET, PLA … - MS-based: - H/D-exchange … - protein painting - crosslinking - kvantitativní: SPR, ITC … - ko-krystalizace, NMR analýza … - genetické metody (syntetická letalita, suprese) - databáze (interactom a komplexy …) - estery reagují s Lys (ε-amin) a amino-koncem - homofunkční spojí proteiny dohromady v jednom kroku (velmi komplexní vzorky pro MS) - intra- (struktura) nebo intermolekulární (PPI) Crosslinking A. ester Sinz, MS Reviews, 2006 Paramelle et al, Proteomics, 2013 B. test • 1. Alanine scan spočívá v: – A. postupném nahrazování (mutagenesi) AMK alaninem? – B. postupném nahrazování (mutagenesi) alaninu bazickými AMK ? – C. hledání alaninu v sekvencích interakčních partnerů? – D. specifickém „scanning“ proteomických dat? • 2. Klasický kvasinkový dvou-hybridní systém využívá principu: – A. reaktivace fluorescence GFP proteinu? – B. reaktivace transkripčního faktoru (většinou Gal4)? – C. reaktivace enzymu DHFR? – D. reaktivace signální dráhy Ras? • 3. Při cíleném „crosslink“ proteinů pomocí BMOE: – A. se kovalentně spojí SH skupiny cysteinů a vznikne disulfidický můstek? – B. se kovalentně spojí SH skupiny cysteinů s crosslinkerem? – C. se kovalentně spojí NH2 skupiny lysinů s crosslinkerem? – D. se nekovalentně spojí opačně nabité AMK? • 4. Metoda FRET využívá principu: – A. reaktivace transkripčního faktoru Gal4? – B. reaktivace fluorescence GFP (komplementací jeho fragmentů)? – C. přiblížení fluoroforu (např. CFP), který emituje světlo o vlnové délce odpovídající absorpčnímu spektru druhého fluoroforu (např. YFP)? – D. fluorescenční resonance etanu? • testy předat příště přednášejícímu nebo poslat na můj E-mail: jpalecek@sci.muni.cz