E2240 Účinky stresorů v ekosystémech 05 Bioindikace v suchozemských ekosystémech – 1. část Jakub Hofman 1 § 2 Úvod - připomenutí 3 Bioindikace metoda, kdy se na základě vlastností biologických systémů odhadují vlastnosti prostředí v širším slova smyslu tím označujeme všechny postupy, kde sledujeme reakce organismů (od jedinců po společenstva) přítomných v prostředí na stres § 4 Bioindikace versus biomonitoring §bio + monitoring §bioindikace je postup §biomonitoring je jeho použití v terénních studiích zejména na více lokalitách nebo opakovaně v čase 5 Bioindikace 6 Bioindikace §sledování chemických látek v odebraných vzorcích bioty ov čemkoliv, preferenčně tzv. bioakumulátory či bioindikační druhy/vzorky (jehličí) §sledování bioty a její odezvy na faktory prostředí obiochemické markery -účinku (stresové proteiny – HSP – heat shock proteiny, chromozomové aberace ...) -expozice (methalothioneiny, EROD - ethoxyresorufin-O-deethylase ...) oindikátorové druhy - přítomnost/nepřítomnost indikuje určitou vlastnost ekosystému -citlivé druhy (např. pošvatky, horské ploštěnky, lišejníky) -oportunní druhy (např. pakomáři, pijavky ...) ostav a funkce organismů opopulace - počty organismů, distribuce, věkové složení ... ospolečenstvo – druhové složení a zastoupení, biodiverzita ostav ekosystému, krajiny – struktura, dynamika, funkce 7 Akumulační bioindikátory §mechorosty – bryomonitoring §lišejníky – kumulace těžkých kovů a radionuklidy §jehličí – smrk, borovice - kumulace těžkých kovů a POPs §vajíčka ptáků §žížaly, šneci § 8 kolonie_tereju DSC00446 Akumulační bioindikátory - příklad § 9 SETAC 2020: 1.04.8 Deciphering the molecular mechanisms of pesticide tolerance of the soil engineer biodiversity Bioindikace §na začátku je nutno si dobře definovat, jaké organismy/parametry budeme sledovat pro posouzení působení stresu: ovztah k působení stresu ohodnocené skupiny: -producenti – rostlinná společenstva -konzumenti – bezobratlí, plazi, ptáci, savci ... -destruenti – půdní mikroorganismy oklíčové druhy, bioindikátory, nebo více druhů, společenstvo oparametry hodnocení -strukturní (taxonomické parametry, biomasa, abundance ...) -funkční (produkce/respirace, potravní řetězce ...) § 10 Bioindikace §vlastní provedení odběrů a analýz bioty: onávrh a rozložení vzorkovacích míst ovzorkování – podle typů organismů .... ocharakterizace a stanovení definovaných biotických parametrů -techniky botanických, zoologických, mikrobiologických a ekologických disciplin ocharakterizace a stanovení kontaminace bioty -techniky analytické chemie a chemie životního prostředí § 11 Půdní kvalita a její bioindikace 12 Půdní kvalita – definice současná a do budoucna udržitelná schopnost půdy fungovat jako živý systém uvnitř ekosystému zabezpečující jeho důležité funkce a služby, podporující biologickou produktivitu, odolávající erozi, nesnižující či zlepšující kvalitu ovzduší, podzemní a povrchové vody a podporující zdraví rostlin, zvířat i lidí http://iheartsoil.files.wordpress.com/2012/03/i-love-soil-poster-image_sm.jpg Indikátory půdní kvality Musí vyhovovat těmto kritériím: §korelace s procesy v ekosystémech (modelování) §musí zahrnovat všechny (většinu) vlastnosti půd a tak být použitelné pro odhad vlastností, které se nedají snadno měřit §musí být snadno měřitelné v terénu §musí být citlivé na změny technologií a přírodních poměrů (klima), avšak necitlivé na krátkodobé změny §soubor indikátorů musí zahrnovat již sledované charakteristiky Indikátory půdní kvality §kvalitativní (např. půda je dobře oživená) §kvantitativní (např. biomasa mikroorganismů je 1450 µg Cbio/g půdy) §v terénu / v laboratoři §složité analýzy pro vědce vs karty pro farmáře Indikátory půdní kvality §Příklad souboru vlastností půd využitelných jako indikátory kvality a zdraví půdy a vztah indikátorů k funkcím půdy Indikátory půdní kvality §snaha propojit s ekosystémovými službami půdy 17 Jensen & Mesman (2006) Půdní mikroorganismy 18 Mikrobiální společenstvo půdy Mikrobiální společenstvo půdy = nbakterie (řetízky či kolonie) naktinomycéty (pseudomycelia) nhouby (hyfy) nřasy nprvoci nkvasinky nviry Picture5 soil-life Biodiversity of soil microorganisms Význam mikroorganismů v půdě nstěžejní v cyklech živin a energií nstojí na počátku potravních řetězců nrozklad organické hmoty (mineralizace) nsyntéza nových sloučenin (immobilizace) ntvorba humusu nudržování půdní struktury, stabilita agregátů nprospěšný vliv na půdní úrodnost a pro růst rostlin nvliv na vodní a vzdušný režim půdy ndegradace celé řady polutantů dark_brown_pr minimmb Proč mikroorganismy ? nsledováním stavu půdních mikroorganismů můžeme nepřímo posuzovat stav celého terestrického ekosystému nna stresové faktory můžeme upozornit velmi brzy nvynikající indikátor biologického potenciálu půd i v přítomnosti stresových faktorů v půdním prostředí ndávají odpověď na přítomnost stresujících faktorů v jejich životním prostředí zejména změnou velikosti společenstva nebo aktivity nzměny v parametrech mohou časně varovat před hrozícím snížením produktivity systému vlivem jakýchkoli stresujících faktorů nmožnost hodnotit: efektivitu zemědělské, lesní rekultivace, zemědělského obhospodařování, hnojení, dále vlivů geneticky upravených organismů vpravených do půdy, vlivů eroze, odlesňování, zasolování apod. npůdní mikrobiální ekotoxikologie může přispět k objektivnímu hodnocení rizik spojených s různými antropogenními zásahy Kolik je v půdě mikroorganismů ? n0,05 - 0,5% hmoty půdy jsou mikroorganismy n 105 až 109 jedinců v 1 g suché půdy n toto množství stačí na zabezpečení veškerých procesů mineralizace a imobilizace a dalších procesů http://www-crcslm.waite.adelaide.edu.au Celkový půdní organický uhlík "živý uhlík" (1-5%) = Mikrobiální biomasa (CBIO) (TOC, CORG) "Neživý uhlík" (95 - 99%) Kde se v půdě MO vyskytují? nnejvětší biomasa mikroorganismů je v humusovém horizontu, v rizosféře a s hloubkou dochází k poklesu nfotolitotrofní mikroorganismy jsou samozřejmě vázané pouze na nejvrchnější vrstvičku půdy nobligátně anaerobní mikroorganismy se nachází spíše ve spodní části horizontů (bez přístupu kyslíku) nmikroorganismy uzavřené v mikro- agregátech jsou dobře chráněné před predací protozoí, ale naopak mohou strádat nedostatkem substrátu A-6 Kde se v půdě MO vyskytují? nRhizosféra nEkologická vazba mikroorganismů na kořeny rostlin nV okolí kořenů je jiné prostředí než jinde v půdě Vodní režim Uvolňuje kořenové exudáty Rostlina Mikroorganismus Produkují např. růstové faktory Uvolňují živiny Energy H2O + CO2 O2 Nutrients from roots NH4+ H2PO4- RCOO- RNH2 CH2O O2 H2O + CO2 CO2 Metabolism Půdní MO jsou ve velmi silné interakci s vlastnostmi půdy nnutriční vlastnosti půdy (zdroj živin pro mikroorganismy) nfyzikálně-chemické vlastnosti: teplota, pH, vlhkost, redoxní potenciál, obsah jílu, složení půdního vzduchu, půdního roztoku, kontaminanty atd. nstruktura půdy, sorpční komplex, půdní typ, půdní druh, využití půdy atd. npůdní roztok npůdní vzduch (N: 78-80%; O2: 0,1-20%; CO2: 0,1-15%) nsorpce/desorpce; půdní komplex; biodostupnost substrátů a kontaminantů nmikroorganismy samy sorbují (G+ více než G-); jíl zvyšuje sorpci nna površích částic se sorbují substráty i extracelulární enzymy (urychlení reakcí a zvýšení stability extracelulárních enzymů) nvlastnosti působí buď přímo, či nepřímo nsezonalita A-7 Bioindikace pomocí mikroorganismů nzachycují skutečnou reakci organismů v přírodních podmínkách nkontaminaci půd nelze plánovat a tedy spočívají v popisu dané konkrétní situace, která je obtížně srovnatelná s jinými případy z důvodu rozdílných koncentrací a typů polutantů, doby kontaminace nebo i půdního typu nměly by být spíše dlouhodobými výzkumy (minimálně jeden rok) vzhledem k výraznému sezónnímu charakteru aktivity půdních mikroorganismů nkontaminace z reálného zdroje zahrnuje zpravidla více druhů polutantů - environmentální směsi nbiologická data doplnit chemickým rozborem a rozborem půdních vlastností nproblém s nalezením odpovídající kontrolní lokality, se kterou by bylo možné srovnávat zjištěné změny v parametrech mikrobiálního společenstva nje nutno očekávat značné ovlivnění výsledků parametry prostředí a dále i sezónním chováním mikrobiologických parametrů (velká časová i prostorová variabilita) Metodická východiska ekotoxikologie půdních MO Výzkumy vedoucí k odhadu druhů, množství a metabolických aktivit biomasy, biodiverzity, stability, funkceschopnosti atd. v půdě zahrnují: nmetody determinace uspořádání a výskytu mikroorganismů v půdě nisolace a charakterizace podskupin a druhů nodhadu množství a typů organismů v půdě nměření biomasy (kvantita a stabilita) ndetekce a měření metabolických procesů (obecných i specifických) nměření aktivity mikroorganismů (růst, ATP apod.) nměření diverzity mikrobiálních společenstev nsledování interakcí (mykorhiza, rhizosféra) Množství i standardizovaný metod ISO Logo Standardy půdních mikrobiálních metod - ISO ISO 14238:2012 Soil quality — Biological methods — Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes ISO 15685:2012 Soil quality — Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification — Rapid test by ammonium oxidation ISO 18187:2016 Soil quality — Contact test for solid samples using the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis ISO 17155:2012 Soil quality — Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves ISO/TS 10832:2009 Soil quality — Effects of pollutants on mycorrhizal fungi — Spore germination test ISO/CD 23265 Soil quality — Test for estimating organic matter decomposition in contaminated soil ISO 16072:2002 Soil quality — Laboratory methods for determination of microbial soil respiration ISO 14240-1:1997 Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 14240-2:1997 Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method ISO 23753-1:2019 Soil quality — Determination of dehydrogenases activity in soils — Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC) ISO 23753-2:2019 Soil quality — Determination of dehydrogenases activity in soils — Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT) ISO/TS 29843-1:2010 Soil quality — Determination of soil microbial diversity — Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/TS 29843-2:2011 Soil quality — Determination of soil microbial diversity — Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method ISO 11063:2020 Soil quality — Direct extraction of soil DNA ISO 17601:2016 Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil ISO 20130:2018 Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using colorimetric substrates in micro-well plates ISO/TS 20131-1:2018 Soil quality — Easy laboratory assessments of soil denitrification, a process source of N2O emissions — Part 1: Soil denitrifying enzymes activities ISO/TS 20131-2:2018 Soil quality — Easy laboratory assessments of soil denitrification, a process source of N2O emissions — Part 2: Assessment of the capacity of soils to reduce N2O ISO 11266:1994 Soil quality — Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under aerobic conditions ISO 15473:2002 Soil quality — Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under anaerobic conditions ISO 14239:2017 Soil quality — Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions biomass enzyme activity diversity •structural •genetic •functional denitrification Odběry půdních mikroorganismů Odběry jako první krok ekotoxikologie MO ndíky vlastnostem mikroorganismů je téměř nemožné je sledovat přímo v terénu (in situ) - jen vyjímky (složitá interpretace) nje tedy potřeba reprezentativní vzorek, se kterým je nakládáno jako se živým systémem, aby se biologické společenstvo příliš neovlivnilo (např. vysušení vzorků, zmrazení, v ledničce ...) ni tak je vždy laboratorní vzorek něco jiného než „reálný svět“ nje tedy nutná určitá standardizace hlavních podmínek 49 Techniky odběrů •zejména kvantifikace může být odběrem a nakládáním se vzorky silně zkreslena •také kvalitativní parametry (aktivita, diverzita) jsou ovlivnitelné odběrem, zpracováním a manipulací se vzorky nHlavním cílem je: n1) získat reprezentativní vzorek n2) minimálně či standardně (víme jak, o kolik) odběrem a manipulací změnit kvantitu nExistuje mnoho metod a teorie kolem vzorkování pro půdu: ISO 10381-6:2009 - Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory Techniky odběrů nvětšinou vysoké obsahy mikroorganismů => stačí aseptické techniky (rýče, vzorkovací tyče - odeberou směsný vzorek, či celé jádro) ndalší techniky: zakopaná sklíčka, pedoskop apod. 36 37 50 Kvantifikace půdních mikroorganismů Přímé mikroskopické počítání bakterií (direct bacterial counts) njde vlastně o první ze dvou "počítacích" technik (druhá je tzv. viable / indirect counts, neboli počítání po předchozí izolaci a kultivaci) nvětšinou vyšší počty než při viable counts (pouze 10% je kultivovatelných); rozdíl lze zjistit tzv. direct viability counts (DVC) - inkubace s nalidixovou kyselinou - Krogurovou metodou (viz. dále) nu půdy je potřeba nejdříve dispergace a separace od půdních částic (ty jsou při těchto technikách vážný problém) npro zlepšení pozorování se užívá řada barviv (FDA, AO, DAPI, FITC atd.) nz přímých počtů lze i odvodit biomasu (musíme ale znát např. průměrnou velikost buněk bakterií či délku hyf hub) 39 Izolace a kultivace MO z půdy npotřeba pro různé účely, např. identifikace specifických mikroorganismů, měření diverzity atd. npočítání mikroorganismů - tzv. viable / indirect counts - použití metod MPN (most probable number) a počítání CFU (colony forming units) nu půdy vhodná extrakce (např. použití surfaktantu Tween 80 s disperzním činidlem pyrofosfát sodný) následuje násobné ředění (vodou, fyziologickým roztokem či pufrem ...) nnásledují obecné kultivačni techniky - metoda agarových ploten: poured a spread plate counts; Výstupem jsou CFU / hmotnost či objem vzorku Schéma spread plate counts From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press Izolace a kultivace MO z půdy 41 41 Izolace jednotlivých druhů půdních MO - využití při potřebě izolovat jednotlivé mikroorganismy, například při analýze biodiverzity či při identifikacích např. systémem BIOLOG apod. 44 From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press Izolace a kultivace MO z půdy Izolace a kultivace MO z půdy Dominantní kultivovatelné půdní bakterie Měření biomasy nBIOMASA = definována (zejména pro půdu) jako žijící část organické hmoty, jako organismy menší než 10 µm3 nnejčastěji se vyjadřuje v jednotkách hmotnosti např. µg Cbio/gsuš. ntyto parametry mají zastřešující povahu - "overall / general parameters" - tzn. stanovujeme mikrobiální biomasu a nevíme co se děje uvnitř ("black box of microbial biomass") nnevychází ze separace či izolace mikroorganismů, stanovují se přímo ve vzorcích půdy nu půdy je Cbio cca 1 - 5% Corg n Dva hlavní typy využití parametrů: 1) stanovení in situ mikrobiální biomasy - posouzení biologické kvality půd - bioindikace půdní kvality 2) stanovení v kontrolovaném laboratorním pokuse - změny pod vlivem kontrolovaného faktoru (testy toxicity) nChloroform-fumigační extrakční metoda (FE metoda, CFEM) nISO 14240-2 (1997): Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method nopět probíhá fumigace, ale vzniká extrakt z obou variant (F a NF), který je analyzován na obsah uhlíku; výhodou je, že extrakt může být analyzován prakticky na cokoliv npokud je analyzován uhlík, lze to provést: ndichromanovou oxidací a následnou titrací či spektrofotometricky noxidací působení K2S2O8 (persulfátu) a UV - vznikne CO2 a ten je měřen IRGA nvýsledek je udáván v µg.gsuš.-1 Mikrobiální biomasa v půdě • 180px-Exsiccator_hg Strukturní vzorec Infusion-Glass-Bottle Mikrobiální biomasa v půdě nMetoda substrátem indukované respirace (SIR) nISO 14240-1 (1997): Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. nzaložena na empirickém vztahu mezi mikrobiální biomasou a potenciální respirací (respirační rychlost během prvních hodin po přidání maximálně využitelného substrátu - glukózy - v saturující koncentraci) nněkdy využívána jako údaj o aktivní složce mikrobiální biomasy nrozsah empirického koeficientu ve validačních studiích: 15 - 54!! n=> lépe používat pouze pro měření potenciální respirace – PR (značí se nejčastěji jako SIR) n Mikrobiální biomasa v půdě 61 Mikrobiální biomasa v půdě nEffects of Zn, Cu, and Ni in sewage sludge on microbial biomass in a sandy loam soil. nZejména Cbio/Corg v půdě je citlivý indikátor dlouhodobých degradací půdní organické hmoty, neboť Cbio se snižuje daleko rychleji než celkový organický uhlík nToxicita pro Cbio v pořadí Cu > Zn >> Ni > Cd 0034 [USEMAP] Aktivity půdních mikroorganismů Aktivity mikroorganismů Mají velmi úzký vztah k jejich funkcím v ekosystému njsou smysluplným a zcela nezbytným doplněním údajů o kvantitě mikroorganismů = nestačí jen vysoké množství mikroorganismů, ale hlavně aby byly funkční, tedy aktivní nco se týká aktivity, je důležitá nejen její úroveň, ale i mnohostranost, diverzita metabolických funkcí nbohužel, téměř vždy (s výjimkou in situ technik) dochází ke zkreslení při přenosu z reálného ekosystému n Příklady často využívaných / měřených mikrobiálních aktivit: nměření respirace; měření mineralizace dusíku; měření fixace dusíku; měření ATP; produkce tepla; měření nitrifikace, sulfurikace, oxidace železa apod.; měření denitrifikace, desulfurikace; měření enzymových aktivit; atd. atd. Bazální respirace njako bazální mineralizace (= bez přídavku substrátu) koreluje s obsahem organické hmoty (Corg) nISO 16072 (2002): Soil quality - Laboratory methods for determination of microbial soil respiration nDůležitý parametr pro biologickou kvalitu půdy – BR (basal respiration) n Limity a nevýhody: naktuální přídavek substrátu ovlivňuje podíl aktivních mikroorganismů nrelativní necitlivost k malým dávkám kontaminantů nnutno kombinovat s jinými parametry (např. mikrobiální biomasa) či potenciální respirace (po přídavku substrátu) nnutno interpretovat s ohledem na obsah a dostupných organických látek v půdě nu terénních měření nutno stanovovat opakovaně v čase – silná sezónní závislost Potenciální respirace npo přídavku lehce využitelného substrátu není již respirace limitována substrátem a dostáváme obraz potenciální respirace - PR - která odráží skutečné energetické potřeby a mineralizační aktivitu mikrobiálního společenstva n nměření např. jako produkce CO2 v metodě SIR 61 Potenciální vs. bazální respirace 64 80% ] ] Mineralizace / respirace / využití C substrátů nRespirometrie - systémy kontinuálně měřící respiraci, přesněji spotřebu kyslíku či produkci oxidu uhličitého nRůzné metody detekce, různý design přístrojů nVyužití pro aerobní i anaerobní aplikace, pro studium biodegradací, kinetiku růstu sledovanou pomocí produkce produktu atd. 85 Respicond%201w Australia%203web OxiTOP – měření respirace pomocí změny tlaku Růstové křivky měřené pomocí produkce CO2 nISO 17155 (2002): Soil quality - Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves nmetoda stanovení "kontaminace" půdy (tzv. ecotoxic potential) a efektu kontaminace v laboratorních studiích Důležité parametry: nlag time - čas od přídavku substrátu do počátku exponenciálního růstu – reflektuje vitalitu "growers„ nrůstová rychlost µ naktivační koeficient respirace: QR = RB/RS nčas k dosažení píku Znečištěná půda: nQR >0,3 nlag > 20h ntpeakmax > 50h 92 Aktivity spojené s přeměnami dusíku Mikroorganismy jsou naprosto stěžejní: 1) kromě sinic a symbiotických bakterií nedovedou organismy poutat N2 2) zpětné uvolňování dusíku do atmosféry 3) transformace forem dusíkatých sloučenin 100 005 Fixace dusíku •N2 je fixován do NH3 : N2 + 6e- à 2NH3 (+630 kJ/mol) • •sinice (hlavně ve vodách - Aphanizomenon, Nostoc, Anabaena); symbiotické bakterie (Rhizobacteriacae - luštěniny); kolem 100 druhů volně žijících bakterií aerobních i anaerobních (Azotobacter, Azospirileum, Beijernickia, Clostridium) • •systémy se liší v množství poutaného dusíku; nejvíce fixují symbiotické asociace, neboť v okolí kořenů je přísun živin 0033 005 •jde o proces spotřebovávající energii; probíhá jen v dobrých podmínkách; je tedy citlivý endpoint ke stresu • •inhibující vliv má obecně amoniak a pro volně žijící fixátory vysoké koncentrace kyslíku; některé ale mají systém chránící nitrogenázu před působením kyslíku Pozn.: organismy kterým stačí N2 jako jediný zdroj dusíku se nazývají diazotrofní Fixace dusíku Měření: Acetylene reduction assay (ARA) -využívá větší afinity nitrogenázy pro acetylen -systém s půdou, případně i s rostlinami, je vzduchotěsný -prostor nad půdou se z 10% nasytí acetylénem či směsí acetylen-kyslík a po několika hodinách se měří ethylen -redukovaný ethylen se stanovuje GC s FID detektorem -užívá se faktor 3 molů ethylenu na 1 mol fixovaného N2 n nje velmi citlivou, levnou a jednoduchou metodou nalternativou je měření fixace 15N - nutná drahá instrumentace (IRMS) nmůže se také sledovat rychlost růstu organismů na médiu bez dusíku nčasto se sleduje také přítomnost hlízek u cílových rostlin Amonifikace •proces kdy se NH3 uvolňuje z glutamátu (uvnitř buněk) •či proces kdy enzymem ureázou se štěpí močovina •nebo extracelulární degradace proteázami, lysozymy, nukleázami nZávislost na množství N v prostředí: • při poměru C:N < 20 převládá amonifikace • při C:N > 20 asimilace nMetodicky lze rozlišit amonifikaci jako bazální úroveň mineralizace N - obdoba bazální respirace v cyklu C; a potenciální amonifikaci po přídavku substrátu (argininu) - obdoba potenciální respirace n 001 001 Mineralizace dusíku nAMONIFIKACE JE SOUČÁSTÍ ŠIRŠÍHO POJMU: MINERALIZACE DUSÍKU nNEBOŤ ČÁST NH3 SE DÁLE OXIDUJE PŘI NITRIFIKACI nmetodicky nelze obě fáze příliš dobře oddělit!!! npokud chceme znát skutečnou (ne potenciální) amonifikaci je jedinou možností měření se značeným dusíkem 15NH4+ či vytvořit anaerobní prostředí zatopením vzorků Amonifikace Měření: Amonifikace - AMO (postup UKZUZ) -vzorek zatopený vodou je inkubován týden při 40°C -stanovení amonných iontů se provádí po extrakci 1M KCl (1:5) spektrofotometricky (ISO 14256): při 630 nm se sleduje zabarvení vzniklé reakcí s NaOCl a phenolátem sodným (salicylanem sodným), katalýza nitroprusidem sodným (Berthelotova reakce) n njinou možností je stanovení iontově selektivní plynovou elektrodou (ISE): amonné ionty se převedou na amoniak při pH 11-13 přídavkem 10M NaOH; potenciál se měří elektrodou, přičemž ke kalibraci se užije roztoků síranu amonného nvyjadřuje se jako µg NH4+-N . gsuš.-1 . d-1 - nAlternativou je měření se značeným dusíkem 15NH4+ Amonifikace - potenciální Měření: Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem -přídavek substrátu (argininu) a stanovení amonných kationtů po 3h inkubace půdy při 30°C -stanovení amonných iontů se provádí po extrakci 2M KCl (1:4) spektrofotometricky (ISO 14256): při 630 nm se sleduje zabarvení vzniklé reakcí s NaOCl a phenolátem sodným (salicylanem sodným), katalýza nitroprusidem sodným (Berthelotova reakce) -jinou možností je stanovení iontově selektivní plynovou elektrodou (ISE): amonné ionty se převedou na amoniak při pH 11-13 přídavkem 10M NaOH; potenciál se měří elektrodou, přičemž ke kalibraci se užije roztoků síranu amonného - nMetoda dává falešné výsledky v kyselých půdách a v půdách po aktuálním přídavku organické hmoty nPAMO není selektivně inhibována cycloheximidem či streptomycinem a proto nelze odděleně měřit amonifikaci bakterií a hub 102 Nitrifikace nvýznamný proces, umožňuje mobilitu dusíku v půdě Dva kroky: I. HN4+ + O2 + 2H+ à NH2OH + H2O à NO2- + 5H+ DG = -66 kcal II. NO2- + 0,5O2 à NO3- DG = -18 kcal noba kroky jsou striktně aerobní nzastává jej jen několik rodů, v půdě první krok např rod Nitrosomonas, Nitrococcus a druhý krok např. rod Nitrobacter nzdrojem uhlíku je pak CO2 nenzym pro první krok je amoniak monooxygenáza (AMO), která má širokou substrátovou specifitu a může kometabolicky oxidovat i některé polutanty např. TCE či alkany až do C8 – využití při bioremediacích !!! 005 002 Nitrifikace Velmi dobrý indikátor stresu, je silně inhibována polutanty - důvody: 1)celý systém zisku energie je velmi náročný: 1. krok potřebuje oxidaci 34 molů amoniaku k fixaci jednoho molu CO2, druhý krok dokonce oxidaci 100 molů NO2- !! 2)dva kroky s přičiněním různých populací, druhý krok je méně energeticky výtěžný (jen 70 kJ/mol!) - pokud kroky navazují, nedochází k negativní kumulaci dusitanů (snižuje pH prostředí, toxický ..) dusitany inhibují první krok !!! 3)obecně už tak dost citlivý proces k environmentálním podmínkám: pH optimum je 6,6 - 8,0; při pH < 4,5 se zastaví Pozn: existují i mikroorganismy heterotrofní, které provádí nitrifikaci a není známo proč; představují minoritní význam ve srovnání s autotrofní nitrifikací Nitrifikace Potenciální nitrifikace (SNA) (NEA - nitrifier enzyme activity) (potential amonium oxidation - PAO) nISO 15685 (2004): Soil quality - Determination of potential nitrification - Rapid test by ammonium oxidation •půda je inkubována v pufrované suspenzi s roztokem chlorečnanu sodného (inhibuje oxidaci dusitanů na dusičnany) s přídavkem saturujícího množství síranu amonného (substrát pro oxidaci amoniaku na dusitany) •po 6 hod či déle, eventuálně každé 2 hodiny se měří koncentrace NO2- •koncentrace dusitanů se měří po extrakci KCl spektrofotometricky reakcí s sulfanilamid a Griess-Ilosvay činidlem = N-(1–naftyl)ethylen-diamin dihydrochlorid •jako referenční látku lze užít nitrapyrin 102 Nitrifikace Měření: Nitrifikace (LNA) nDelší inkubace se příliš nedoporučují, neboť mohou probíhat změny společenstva. nISO 14238 - Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes npůda inkubována po přídavku 1% síranu amonného; po 1-3 týdnech stanovení zbylého NH4+ či vzniklého NO3- njak pro stanovení jako parametru kvality půdy ntak pro testování toxicity látek na N mineralizaci Test toxicity: •půda pro test toxicity musí být s Corg 0,5 - 1,5% a nízkým obsahem jílu •přidává se organický zdroj dusíku - vojtěška (C:N = 16) •testovaná látka se přidá v cca 5 koncentracích a po 28 denní inkubaci se měří NO3- •výsledkem je procentuální inhibice N mineralizační potenciál nPři stanovení mineralizace dusíku se často spojují oba procesy (amonifikace a nitrifikace) v tzv. N mineralization potential nje to vyprodukovaná suma NH4+ + (NO2-)+ NO3- v půdě na konci inkubace (extrakce roztokem KCl) npokud testujeme vliv chemické látky, dostáváme klasický vztah dávka odpověď s IDs nStanovení koncentrace dusičnanových a dusitanových aniontů v půdách: Dusitany ndle ISO 14256 spektrofotometricky - reakcí s Griess-Ilosvayovým činidlem (sulfanilamid a N-1-naftyl etylendiamin chlorid) tvoří azobarvivo (543 nm) Dusičnany nnejprve nutno redukovat na dusitany (reduktor z kadmia – Devardova slitina) a pak stejné stanovení nnebo UV spektrofotometrií při 210 nm nnebo iontově selektivní elektrodou ISE nv dnešní době existují automatické analyzátory: FIA - flow injection analyzator N mineralizační potenciál nISO 14238 (1997): Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes 101 Denitrifikace nv anaerobních podmínkách ndusitany a dusičnany slouží jako TEA nN2O – skleníkový plyn !!! nMěření: kolorimetrickými technikami, iontově selektivními elektrodami, metodou "acetylene block" (zablokuje N2O reduktázu a N2O je měřen GC) 005 Respirace - typy Enzymatické aktivity Sledování enzymatických aktivit - enzymy v půdě -obecný princip spočívá v přídavku nadbytku substrátu a sledování jeho úbytku či produkce produktu za současné inhibice růstu mikroorganismů -měří se enzymatický potenciál či kinetické parametry Vmax n Nejčastěji sledovány: n dehydrogenázy n proteázy - inkubace s kaseinátem sodným n ureázy - inkubace s močovinou n amidázy n fosfatázy n celulázy n β - galaktozidázy 159 Dehydrogenázová aktivita nenzym, který z ekotoxikologického hlediska vysoce převažuje všechny ostatní ndehydrogenázová aktivita je tedy mírou celkové mikrobiální aktivity 167 Diverzita půdních mikroorganismů Biodiverzita půdních mikroorganismů Biodiverzita taxonomická strukturální funkční genetická ?? interpretace ?? ?? kvantitativní míry ?? ?? vzájemné vztahy markerů ?? Analýza lipidů nPLFA jako biomarkery ninformují o složení mikrobiálního společenstva: n n n n n nposkytují ale i další informace: n Funkční diverzita – systém Biolog 121 0026 0026 Genetická diverzita MO Nejčastější metody pro zisk „genetického fingerprintu společenstva“ nARDRA - amplifikovaná ribosomální DNA restrikční analýza nRFLP - restrikční analýza mnohotvárnosti délky fragmentů nT-RFLP - koncová restrikční analýza mnohotvárnosti délky fragmentů nDGGE - denaturující gradientová gelová elektroforéza nTGGE - teplotní gradientová gelová elektroforéza nARISA - automated ribosomal intergenic spacer analysis - různorodost délek mezi geny malé a velké ribozomální podjednotky nMicroarrays - mikročipy nSIP (stable isotope probing) – značení stabilními izotopy Snímek 72 Kombinace přístupů Kombinace přístupů 132 Kombinace přístupů Doelman & Eijsackers (2004) Kombinace přístupů 0035 Kombinace přístupů 150 Ukázky metod hodnocení mikrobiální kvality půd nviz cvičení E2241 Literatura Pankhurst, C.E., Doube, B.M., Gupta, V.V.S.R. (1997): Biological indicators of soil health. CAB International, Wallingford. ISBN 0851991580. Doran, J. W., Parkin, T. B. (1994): Defining and assessing soil quality. In: Defining soil quality for a sustainable environment. SSSA special publication number 35. SSSA, Inc., American Society of Agronomy, Inc. Madison, Wisconsin, USA, 1994, pp. 3 – 21. Sáňka, M., Materna, J. (2004): Indikátory kvality zemědělských a lesních půd ČR. Edice Planeta. Odborný časopis pro životní prostředí. Ročník XII, číslo 11/2004, ISSN 1213-3393. Jensen J. & Mesman M. (2006). Ecological risk assessment of contaminated land. Decision support for site specific investigations. Report 711701047. RIVM, Netherlands Doelman P. & Eijsackers H.J.P. (2004): Vital Soil - Function, Value and Properties. Elsevier. 358 p. ISBN: 0-444-51772-3 Maier, R.N., Pepper, I.L, Gerba, C.P. (2000): Environmental Microbiology. Academic Press, ISBN: 0124975704, 608 pp. Atlas, R.M., Bartha, R. (1997): Microbial Ecology: Fundamentals and Applications (4th Edition). Addison-Wesley Pub Co, ISBN: 0805306552, 306 pp. Paul, E.A., Clark, F.E. (1996): Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, ISBN: 0125468067, 340 pp. Tate, R.L. (2000): Soil Microbiology (2nd Edition). John Wiley & Sons, ISBN: 0471317918, 536 pp. Alef, K., Nannipieri, P. (1995): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, ISBN: 0125138407, 576 pp. Burlage, R.S., Atlas, R., Stahl, D. (1998): Techniques in Microbial Ecology. Oxford University Press, ISBN: 0195092236. Hurst, C.J., Crawford, R.L., Knudsen, G.R. (2002): Manual of Environmental Microbiology. Amer Society for Microbiology, ISBN: 155581199X, 1138 pp. Pepper, I., Gerba, C. (2005): Environmental Microbiology: A Laboratory Manual. Academic Press. Gill, R., Ramos-Rodriguez, O. & Raine, N. Combined pesticide exposure severely affects individual- and colony-level traits in bees. Nature 491, 105–108 (2012). https://doi.org/10.1038/nature11585 79