—kapilární elektroforéza – STR —sekvenování – NGS — —pro forenzní účely - masivní paralelní sekvenování — — —https://www.youtube.com/watch?time_continue=125&v=KJ7S_efaoI — —https://www.youtube.com/watch?v=zBPKj0mMcDg — —NGS umožňuje zkoušejícím získat data, která pokrývají celý lidský genom a řeší širší spektrum otázek v jediném cíleném testu. Kromě toho jsou volání krátkých tandemových repetic (STR) generovaná NGS plně kompatibilní se současnými formáty databází. NGS se také může zaměřit na sady markerů jednonukleotidového polymorfismu (SNP), které nejsou běžně dostupné pomocí tradičních metod založených na CE, a vyhodnocovat forenzní mitochondriální DNA (mtDNA). Studie poskytují slibný pohled na výhody, které NGS přináší při analýze i těch nejmenších, nejvíce ohrožených a velmi smíšených důkazních vzorků. —množství DNA 1 ng — —SNP —bodové mutace v rámci celého genomu —4 varianty, resp. 2 —diskriminace: 40 SNP = individuální shoda Obsah obrázku stůl —velké množství dat —jednoznačné závěry u výstupů (barva vlasů a očí) —kompatibilita se současnou databází (CODIS) — —Avidity Sequencing™ Technology Video (youtube.com) —Systém AVITI generuje polonie pomocí tzv. rolling circle amplification – RCA. • Každá polonie je souvislé vlákno DNA s mnoha sekvenačními místy (103 kopií původního templátu). • RCA eliminuje propagaci chyb PCR a přeskakování indexů a zároveň snižuje AT/GC bias — a black and white photo of a car with a cracked window Aplikace ​ Panel ​ Identifikace obětí, DVI, pohřešované osoby ​ Precision ID mtDNA Whole Genome Panel​ Precision ID mtDNA Control Region Panel​ Precision ID Identity Panel​ Ion AmpliSeq HID Y-SNP Research Panel v1​ Combination: Ion AmpliSeq VISAGE-Basic Tool Research Panel, Ion AmpliSeq HID Y-SNP Research Panel v1, and Precision ID mtDNA Whole Genome Panel​​ Vyšetřování stopy Precision ID Ancestry Panel​ Ion AmpliSeq PhenoTrivium Panel ​ Ion AmpliSeq VISAGE-Basic Tool Research Panel​ Navenek viditelné znaky​ Ion AmpliSeq PhenoTrivium Panel ​ Ion AmpliSeq VISAGE-Basic Tool Research Panel​ Ion AmpliSeq DNA Phenotyping Panel​ Bio Geografický původ Precision ID Ancestry Panel​ Ion AmpliSeq PhenoTrivium Panel ​ Ion AmpliSeq VISAGE-Basic Tool Research Panel​ Ion AmpliSeq MH-74 Plex Research Panel​ Počet přispěvatelů, dekonvoluce směsí Ion AmpliSeq MH-74 Plex Research Panel​ Precision ID GlobalFiler NGS STR Panels​ Mitochondriální DNA (mtDNA) ze vzorků nalezených při hromadných neštěstích a z jiných neidentifikovaných pozůstatků lze běžně analyzovat, což pomáhá při identifikaci člověka a určení vazeb na příbuzné členy rodiny. Panely krátkých tandemových repetic (STR) poskytují genotypizaci STR s vysokým rozlišením pro analýzu složitých směsí. Analýza předků informující o původu nebo fenotypová analýza jednonukleotidových polymorfismů (SNP) může pomoci vytvořit vyšetřovací stopy v případě, že podezřelí nejsou známi. SNP testující identitu mohou přiřadit znehodnocený vzorek z místa činu ke známé referenci, pokud jsou pomocí autozomální analýzy STR získány dílčí výsledky. — — Panel NGS STR Precision ID GlobalFiler v2 společnosti Applied Biosystems obsahuje 36 markerů, včetně stejných 21 autozomálních STR, Y markerů a amelogeninových pohlavních markerů, které jsou obsaženy v sadě GlobalFiler PCR Amplification Kit, a 14 dalších informativních markerů pro forenzní analýzu. Při analýze pomocí NGS tyto markery odhalí více alel (74 %), než kolik jich bylo identifikováno pomocí tradiční analýzy CE, a to díky sekvenční diverzitě v rámci alel CE stejné velikosti. Tyto izometrické alely lze použít k řešení složitých profilů a směs. Obsah obrázku text, snímek obrazovky, číslo, diagram Popis byl vytvořen automaticky —Converge Software SNP analýza poskytuje řadu metriky pro sledování kvality sekvenování, včetně pokrytí zarovnaných čtení k hotspotu, zkreslení řetězce, počtu čtení. obsahujících každou bázi v hotspotu, volání genotypu a počet genotypů. kvality a frekvence hlavních alel. Terciární biogeografie Analýza předků spočívá v generování odhadu tzv. Obrázek 9. Výsledky Y-haploskupiny z panelu Precision ID Identity Panel. Zobrazené atributy jsou HaploGroup, odvozené alely, všechny markery, které jsou v rozporu s hlášenou linií Y, a klad Y (červeně: ancestrální SNP; zeleně: mutantní SNP; šedě: žádné údaje).Předpověď příměsí (obrázek 8) a populační pravděpodobnosti (na základě algoritmů od Kena Kidda). Analýza identity se skládá z výpočtu pravděpodobnosti náhodné shody (RMP) na základě genotypových frekvencí vygenerovaných z údajů z databáze 1000 Genomes Project, jakož i z Y-haploskupiny. Předpovědi.C — —Fenotypizace DNA může být užitečná pro získání vodítek pro vyšetřování v případech, kdy profily STR nevedly ke shodě s databází. Panel fenotypizace DNA Ion AmpliSeq se používá k předpovědi barvy vlasů a očí pomocí 24 fenotypových SNP ze systému HIrisPlex. Tento panel se zaměřuje na 23 SNP a jeden indel z následujících genů: MC1R, SLC45A2, ASIP/PIGU, EXOC2, HERC2, IRF4, KITLG, OCA2, TYR, SLC24A4 a TRYP1. Výsledky naznačující pravděpodobnost modré, střední nebo hnědé barvy očí spolu s odstínem černých, hnědých, zrzavých nebo blond vlasů poskytuje predikční model HIrisPlex. — —Y-chromozomální haploskupiny přiřazené na základě mužských specifických Y-chromozomálních jednonukleotidových polymorfismů (Y-SNP) umožňují identifikaci otcovské linie a odvození otcovského bio-geografického původu, což má význam pro forenzní genetiku. Výzkumný panel Ion AmpliSeq HID Y-SNP umožňuje analýzu 859 Y-SNP k odvození 640 haploskupin Y. Předběžné forenzní vývojové validační testy ukázaly, že výkonnost tohoto nástroje Y-SNP MPS je vysoce přesná, citlivá a robustní. —Rostoucí výzkum v oblasti použití alternativních markerů ve forenzní genetice napomohl k určení metod, jak získat více genetických informací z náročných vzorků. Využití biogeografického původu, fenotypizace DNA a rodových markerů může poskytnout vodítka pro vyšetřování odložených případů a případů, kdy neexistují podezřelí. Panel Ion AmpliSeq PhenoTrivium obsahuje předky, fenotypizaci DNA a markery mužské linie pro celkem 200 autozomálních SNP a 120 chromozomálních SNP Y v jednom panelu. Diepenbroek et. al. ukazují, že s panelem lze získat spolehlivé předpovědi původu a fenotypu až do 125 pg genomové DNA (gDNA) a další výhody kombinace předpovědí původu, fenotypu a mužské linie na vzorcích případů. —Analýza alternativních typů markerů může doplnit výsledky CE-STR u náročných vzorků, jako jsou komplexní směsi nebo znehodnocené vzorky, a vytvořit tak vodítka pro vyšetřování. Mikrohaplotypy vznikly jako alternativní marker k tradiční typizaci STR-CE díky aditivní vylepšené analýze směsí a možnostem predikce biogeografického původu, které upřednostňují jejich použití u forenzních vzorků. Výzkumný panel Ion AmpliSeq MH-74 Plex je test o délce 157-325 bp zahrnující 74 mikrohaplotypů (230 SNP) vybraných ze souboru 130 mikrohaplotypů dříve charakterizovaných laboratoří Kidd Laboratory. Mikrohaplotypy byly vybrány na základě vysokých hodnot Ae (efektivní počet alel) a In (informativnost), aby se zvýšila schopnost dekonvoluce směsí a předpovědi biogeografického původu. Oldoni et. al. prokázali citlivost až do 50 pg genomové DNA (gDNA) a užitečnost testu při analýze komplexních směsí pro doplnění výsledků typizace CE-STR. — sekvence DNA dlouhou několik tisíc nukleotidů obsahující pár lokusů SNP —sekvenci DNA kratší než 300 párů bází, ve které se nachází dva nebo více lokusů SNP —studium struktury populace z evolučního hlediska optikou vazebné nerovnováhy (LD) —existenci specifických míst v genomu s vysokou mírou LD, definovaných jako haplotypové bloky (také haplobloky nebo LD bloky) nebo jako oblasti, ve kterých se vyskytuje jen omezený počet haplotypů, patrně kvůli nedostatečnému množství dosud proběhlých rekombinací v rámci daného regionu —MH haplotypy – zmapování jednotlivých populací – populační studie —NGS – Illumina nebo Ion Torrent S5 —v současné době eviduje celkem 198 mikrohaplotypových lokusů —využití při určování původu nebo identifikaci osob, kdy se uplatnila rozlišná frekvence alel v závislosti na studované populaci a nízká míra rekombinace —délka telomér - při narození - délka 15 až 20 tisíc párů bází (TTAGGG) —prodlužování telomér mechanismem ATL - korelace mezi délkou telomér a věkem jedince (R2 = 0.692) při vyšetření 60 individuí a aplikaci metody Southern blotu se sondou hybridizující k repetetivní sekvenci telomery – zdlouhavé a náročné na materiál —qPCR v kombinaci s unikátním genem, qPCR Taqman STELA (Single Telomere Length Analysis) zaměřené selektivně na určení délky telomér pohlavních chromozómů —rozdílná délka a rychlost zkracování v různých typech tkání —mtDNA – vyšší věk spojen s vyšším počtem mutací —novorozenec do 3 měsíců: průkazu přítomnosti transkriptů genů pro gamma hemoglobiny (HBG1n1, HBG1n2, HBG2n2 a HBG2n3) – krve —T-lymfocyty - detekci cirkulárních produktů somatické rekombinace probíhající v T-buňkách při somatických přestavbách v genech pro receptory T-buněk (TCR), korelace - R2 = 0,835; se vzrůstajícím věkem se snižuje frekvence těchto přestaveb a tím i frekvence jejich vedlejších cirkulárních produktů vzniklých excizí (metoda pomocí qPCR, nevýhoda – materiál) —metoda array - llumina Human Methylation Microarray poskytne výsledek informující o metylaci 27 578 CpG dinukleotidů umístěných celkem ve více než 14 000 lidských genech —s postupujícím věkem dobře korelují změny metylace v genech EDARADD, TOMA1L1 a NPTX2, byl vytvořen regresní model se schopností predikovat věk jedince s přesností 5,2 roku - po izolaci dochází ke konverzi nemetylovaného C na U, pyrosekvenování a přepočet věku —domácí a divoká —identifikace konkrétního jedince —podobná lidské – STR —pro kočky STR kit - 14 lokusů (260 bp)(trichologický materiál na oblečení majitele – identifikace), taktéž pro psy – 9 lokusů (350 bp), STR k využití identifikace - 21 di a 3 tetra —podobně jsou STR pro ovce (16 STR), skot (di - 16 STR), koně, velbloudy —slon – ve spojitosti se slonovinou, nález části těla —nosorožci (12 STR) — —mtDNA —sekvence - porovnání s referenční – určení druhu —SNP —hybridi – určená druhu (lama, vikuňa, alpaka a guanaco) —CITES — — — —cesta, jak zamezit šíření drogy —technické konopí a s obsahem THC —13 STR —marihuana - nižší diverzita u technického konopí —SNP pomocí NGS —určení geografického původu více jak 100 STR —Nutná databáze vzorků k porovnání —NGS - díky rozvoji možná identifikace, interdisciplinární obor —určení druhu hmyzu —určení mikrobiomu v kosterních ostatcích —určení smrti – postmortem intervalu —určením tělesných tekutin, mikroflora indentifikační znak – přenos spolu s tDNA osoby —mikroorganismy v půdě a jejich přenos na obuv —toxické látky – bioterorismus —16S RNA – porovnání s databázemi + bioinformatika — — — —mnohem stručnější, než znalecký posudek —prioritně zajímá odpověď na položenou otázku —co, kdy, kde, kdo a komu —co bylo předloženo —otázky dožadujícího —výsledky zkoumání dle otázek (výsledky testů, stav profilu DNA, jeho použitelnost, informace o porovnání, zda byl profil DNA uložen) —co se stalo se stopami a srovnávacími vzorky — — —pevnější struktura —soud není oprávněn hodnosti závěry znalce po věcné stránce, může však srovnávat obsah znaleckého posudku s ostatními provedenými důkazy —znalecký posudek by se zásadně neměl vyjadřovat k právním otázkám, ale omezit se pouze na řešení otázek odborných —znalecký posudek musí být prostý úvah a domněnek, musí však bezezbytku odpovídat na zadané dotazy. — —I. Nález – co bylo ke zkoumání předložené, co má být zjištěno a jaké metody byly použity, výsledky —II. Posudek – otázka – zkrácená odpověď —znalecká doložka, vč. Informace jak bylo se stopami a izoláty naloženo —jiná razítka, jinak svázaný (vč. trikolórního provázku, přelepení hřbetu) — —ohledání místa činu – vyhledání relevantních biologických stop - zajištění stopy přímo (např. na odběrový tampon) popř. i s nosičem (např. oblečení) —v laboratoři provedení orientačních a specifických testů – určení druhu x latentní stěry —izolace DNA - dle typu materiálu —kvantifikace DNA - určení několika parametrů v 1 kroku při minimální spotřebě materiálu —amplifikace DNA – namnožení lokusů dle použitého kitu —kapilární elektroforéza – fragmentační analýza STR —vyhodnocení – upotřebitelný x neupotřebitelný profil DNA; shoda s osobou x se stopou x není shoda —databáze DNA (FODAGEN, Info DNA, CODIS, Info Web, IS Shoda)