prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Cytoskelet * 1/2) CYTOSKELET A JEHO FUNKCE – základní složky cytoskeletu (mikrofilamenta, intermediární filamenta, mikrotubuly) - jejich struktura a funkce; dynamická nestabilita, cytoskeletální toxiny, příklady proteinů asociovaných s mikrofilamenty a mikrotubuly a jejich funkce, molekulární motory – typy a funkce, centrozom a jeho cyklus, cilia – primární a pohyblivá. Pohyb buněk a přispění buněk k pohybu organismu: pohyblivá cilia, mitóza vč. funkce cytoskeletu v mitóze, pohyb buňky po substrátu – základní mechanismy a účastnící se proteiny, svalový stah z molekulárního pohledu – příčně pruhovaný a hladký sval. * * 3-4) ZÁKLADNÍ PRINCIPY SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE - základní dělení jednotlivých typů buněčné signalizace, pozitivní a negativní zpětná vazba vč. příkladů, hlavní biochemické mechanismy (fosforylace a výměna GTP/GDP) a jejich regulace, přehled základních typů membránových receptorů; druhý posel – principy a hlavní příklady; vápníková signalizace, receptory spřažené s trimerickými G proteiny, receptorové tyrosin kinázy, malé GTPázy, funkce rhodopsinu v procesu vidění. VÝZNAMNÉ SIGNÁLNÍ DRAHY - signální dráhy významné pro regulaci embryonálního vývoje a imunologie – JAK/STAT, NFkB, TNFa, Wnt, TGF/BMP, Hedgehog, Notch (pouze nejzákladnější principy a klíčové proteiny). * * 4) BUNĚČNÁ BIOLOGIE V ČÍSLECH (pro člověka) – velikost lidské buňky, počty hlavních biomolekul v buňce, počty buněk v těle, velikost – voda, lipidové membrány, proteinů, ribozomu, cytoskeletu (včetně rozlišení elektronového a optického mikroskopu), délka a počet bazí DNA, počet genů, délka buněčného cyklu, délka „života“ buněk – krátce a dlouze žijící buňky, rychlost pohybu buňky a motorů po cytoskeletu, rychlost nervového vzruchu Nejpočetnější proteiny v buňce? * Proteiny jako molekulární stroje, DNA jako návod na jejich výrobu a malé metabolity jako palivo a základní součástky * Reálná data – početnost proteinů v buňce • figure_16_01a.jpg figure_16_01b.jpg Image Jessica Henty-Ridilla @cytoskeletown Watching cells is one of the best parts of my job! actin filaments (purple to yellow), microtubules (white), and a nucleus (blue) in a neuronal cell. Jessica Henty-Ridilla @cytoskeletown Watching cells is one of the best parts of my job! actin filaments (purple to yellow), microtubules (white), and a nucleus (blue) in a neuronal cell. Aktinová filamenta = mikrofilamenta * zvaná také mikrofilamenta * spirálovitá vlákna/polymery tvořené proteinem aktinem * tvoří flexibilní struktury o průměru 8 nm, které mohou být organizovány do lineárních svazků, dvou- či trojrozměrných sítí * jsou rozprostřena po celé buňce, ale koncentrována jsou především přímo pod cytoplasmatickou membránou • • * * Aktinová filamenta = mikrofilamenta * i) jednoduché aktinové filamentum * ii) microvilli * iii) stresová vlákna (červeně) končící ve fokálních adhezích (zeleně) * iv) příčně pruhovaný sval Mikrotubuly * dlouhé duté válce tvořené proteinem tubulinem (vnější průměr 25 nm) * tužší oproti aktinovým filamentům * dlouhá rovná vlákna, často jedním koncem uchycená v mikrotubuly-organizujícím centru (MTOC) zvaném centrozom • • * * Mikrotubuly * i) jednoduché vlákno mikrotubulu * ii) průřez na bázi 3 cilií zobrazující triplety mikrotubulů * iii) mikrotubuly (zeleně) a organely (červeně) v interfázi * iv) prvok s ciliemi Intermediární filamenta * vlákna strukturou připomínající lano s průměrem 10 nm * tvořena heterogenní rodinou proteinů * jeden typ intermediárních filament (IF) tvoří jadernou laminu pod jadernou membránou * další typy IF jsou rozprostřeny napříč cytoplasmou a zajišťují mechanickou odolnost buňky * v epiteliálních tkáních IF zajišťují spojení buněk mezi sebou • • * * Intermediární filamenta * i) jednotlivá intermediární filamenta * ii) IF (modře) v neuronech * iii) epiteliální buňka * iv) jaderná lamina Aktinová filamenta = mikrofilamenta figure_16_11.jpg Aktinová filamenta = mikrofilamenta figure_16_13a.jpg Polymerizace a depolymerizace * dva konce mikrofilament anebo mikrotubulů polymerizují různou rychlostí * rychle rostoucí konec se nazývá „plus konec“, pomaleji rostoucí konec označujeme jako „minus konec“ * rozdíl v rychlosti polymerizace je dán rozdílnou potřebou změny konformace podjednotky v momentu připojení k polymeru * • • • * • Polymerizace a depolymerizace Hydrolýza nukleotidů * každá molekula aktinu nese pevně navázanou molekulu ATP, která je hydrolyzována na molekulu ADP brzy po jejím připojení k polymeru * stejně tak molekula tubulinu nese pevně navázanou molekulu GTP, která je po připojení k polymeru hydrolyzována na GDP * hydrolýza navázaného nukleotidu snižuje vazebnou afinitu této podjednotky k polymeru a zvyšuje pravděpodobnost její disociace z polymeru * proto je obvykle T forma připojena k polymeru a D forma z polymeru disociuje panel_16_02_06.jpg ATP a GTP čepičky panel_16_02_07.jpg * rychlost připojování podjednotek k rostoucímu polymeru mikrofilamenta či mikrotubulu může být větší než rychlost, se kterou je nukleotid nové podjednotky hydrolyzován * v tomto případě na konci polymeru rozeznáváme tzv. ATP či GTP čepičku, která obsahuje nukleosid trifosfáty (ATP na mikrofilamentu či GTP na mikrotubulu) * Dynamická nestabilita * mikrotubuly depolymerizují 100x rychleji od konce s GDP než od konce s GTP * GTP čepička podporuje polymerizaci, pokud je GTP čepička ztracena, dochází k depolymerizaci • • * • * u jednotlivých mikrotubulů se tak střídá stav pomalé polymerizace a rychlé depolymerizace = dynamická nestabilita * Cytoskeletální toxiny Látka Účinek na cytoskelet Mechanismus Zdroj ACTIN Latrunculin depolymerizuje váže aktinové podjednotky mořské houby Cytochalasin B depolymerizuje kryje plus konec filament Nižší houby Phalloidin stabilizuje váže se podél filament muchomůrka MIKROTUBULY Taxol® (Paclitaxel) stabilizuje váže se podél filament keř tis Nocodazol depolymerizuje váže podjednotky tubulinu syntetický Colchicin depolymerizuje kryje konce filament ocún * brání polymerizaci či depolymerizaci • • * • Proteiny asociované s aktinem * většina buněk obsahuje více než 100 různých proteinů asociovaných s aktinem a je pravděpodobné, že řada dalších takových proteinů nebyla ještě identifikována * panel_16_03.jpg Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem Proteiny asociované s aktinem figure_16_16d.jpg Proteiny asociované s aktinem figure_16_17.jpg Proteiny asociované s aktinem figure_16_18.jpg figure_16_18.jpg Filopodia a formin Proteiny asociované s aktinem figure_16_20.jpg Aktinová filamenta = mikrofilamenta figure_16_21.jpg Aktinová filamenta = mikrofilamenta Proteiny asociované s aktinem figure_16_23.jpg figure_16_23.jpg ve filopodiích ve svalech Proteiny asociované s aktinem figure_16_24a.jpg figure_16_26.jpg Myosiny – molekulární motory pohánějící auta na aktinové dálnici figure_16_40.jpg Myosiny – molekulární motory pohánějící auta na aktinové dálnici figure_16_41a.jpg Myosin V na mikrofilamentu Mikrotubuly figure_16_42ab.jpg Mikrotubuly figure_16_44b.jpg Dynamická nestabilita mikrotubulů figure_16_44a.jpg Dynamická nestabilita mikrotubulů figure_16_44c.jpg figure_16_44c.jpg Microtubule catastrophe Centrosom figure_16_48.jpg Mikrotubuly – MTOC (microtubule-organizing center) figure_16_47a.jpg figure_16_47b.jpg Mikrotubuly – MTOC (microtubule-organizing center) figure_16_46.jpg Mikrotubuly – MTOC (microtubule-organizing center) γ-TuSC – gamma tubulin small complex Mikrotubuly figure_16_47c.jpg Proteiny asociované s mikrotubuly * většina buněk obsahuje více než 100 různých proteinů asociovaných s mikrotubuly a je pravděpodobné, že řada dalších takových proteinů nebyla ještě identifikována * Proteiny asociované s mikrotubuly Proteiny asociované s mikrotubuly Proteiny asociované s mikrotubuly figure_16_51.jpg Výsledek obrázku pro microtubules in axon Proteiny asociované s mikrotubuly figure_16_52.jpg Proteiny asociované s mikrotubuly figure_16_54.jpg Molekulární motory vozící vozidla po mikrotubulové silnici: kinesiny a dyneiny figure_16_56.jpg Kinesin 1 na mikrotubulu Struktura dyneinu figure_16_58b.jpg Dyneinový komplex Proteiny asociované s mikrotubuly figure_16_60.jpg Dynein na mikrotubulu Funkce dyneinu v melanosomu figure_16_61.jpg Centrosom a jeho dynamika Cilium (řasinka) – pohyblivá nebo primární cilium Výsledek obrázku pro primary cilia vs motile cilia Primární cilium – vznik bazálního tělíska a jeho ukotvení figure_16_66a.jpg Primární cilim – obsahuje modifikovaný tubulin figure_16_73.jpg Primární cilim – obsahuje modifikovaný tubulin Recyklace kinesinu a dyneinu v primární cilii Výsledek obrázku pro kinesin in cilia Intermediární filamenta * vlákna strukturou připomínající lano s průměrem 10 nm * tvořena heterogenní rodinou proteinů * jeden typ intermediárních filament (IF) tvoří jadernou laminu pod jadernou membránou * další typy IF jsou rozprostřeny napříč cytoplasmou a zajišťují mechanickou odolnost buňky * v epiteliálních tkáních IF zajišťují spojení buněk mezi sebou • • * * figure_16_67.jpg Intermediální filamenta Intermediální filamenta * Laminy (jaderná membrána) * •Velmi specifické pro individuální buněčné typy * Vimentin – mesenchymální buňky * Desmin – sval * GFAP – gliální buňky * Keratiny – epitheliální buňky * Neurofilamentové proteiny (NF-L atd.) - neurony figure_16_68.jpg Keratin v epiteliálních buňkách Vimentin Cytoskeletální realita běžné buňky figure_16_72.jpg Extra slides * Hydrolýza nukleotidů * situace na „plus konci“: • • * • * polymer bude růst, pokud C=Cc (kDon a kToff můžeme zanedbat, protože jejich hodnoty jsou obvykle velmi malé), takže polymer roste, když: * panel_16_02_06.jpg Hydrolýza nukleotidů * jedná se o stabilní stav, ale nikoli o skutečnou rovnováhu, protože ATP či GTP, které jsou hydrolyzovány, musí být doplněny reakcí, kdy podjednotka polymeru přechází z D formy do T formy * panel_16_02_06.jpg panel_16_02_06.jpg Polymerizace a depolymerizace * lineární polymery proteinových molekul, kterými jsou mikrofilamenta nebo mikrotubuly tvořeny, vznikají připojováním podjednotek (monomerů) ke koncům polymeru * míra připojování/polymerizace těchto podjednotek je dána konstantou kon (jednotka M-1s-1), míra depolymerizace je dána konstantou koff (jednotka s-1) • • * •