Metody vývojové biologie
Gallus
gallus f. domestica – kuřecí embryo
Proč kuře?
• časný vývoj podobný savcům
• homologie v genomu člověka a kuřete
• jednoduché na chov (líheň 37,8 o C)
• rychlý vývoj – přibližně 21 dní
• legislativa – kuřecí embrya nejsou považována za
experimentální zvířata
• In ovo - jednoduchá manipulace a snadno
ovlivnitelný vývoj přímo ve vajíčku
Význam kuřecího modelu
• spousta buněčných a molekulárních pochodů ve vývoji byla
popsána poprvé právě u kuřete:
• migrace buněk neurální lišty
• určení dorzo-ventrální osy neurální trubice
• vývoj končetin
• tvorba krevních cév
• segmentace somitů
• určení pravo-levé asymetrie těla
Chorioallantoic membrane (CAM) assay
• CAM: allantois a chorion srůstají 6.-7. ED
• Funkce CAM: výměna plynů a příjem vápníku z porézní
skořápky, exkrece sodíku a chloridů z allant.vaku, rezervoár
odpadních produktů
Kweon-Ho Nam et al., 2015Ribatti 2022
Chorioallantoic membrane (CAM) assay
• Murphy, 1913 – inokulace „Jensen rat sarcoma“ na CAM
kuřecího embrya
• Před E18 není imunitní systém kuřat plně vyvinutý imunodeficientní
prostředí
• Studium angiogeneze, růstu a invazivity nádorových buněk
a metastazování
• Hodnocení „distribuce“ léků a terapeutických látek
Chorioallantoic membrane (CAM) assay
Matsumoto et al., 2018
Liu et al., 2013
Praktická část
• Seznámení se s In ovo přístupem
• Implantace kuliček
- Testování efektu určitého morfogenu na vývoj vybrané tkáně
- Kuličky (200 um) jsou nasáklé morfogenem, který se po aplikaci
pozvolna uvolňuje do tkáně
• Transplantace tkáně (chiméry)
Inkubace a manipulace
• Vývoj embrya v oplodněném vejci
v laboratoři začíná vložením vajec do
inkubátoru (37,8 °C, konstantní vlhkost)
• Vejce musí být položeno na stranu (A)
• Po 1,5 dni (cca 36 hodinách = HH 10)
odsáváme bílek (embryo klesne) (B),
vystříháme drobný otvor do skořápky (C),
který následně přelepíme a vejce vracíme
zpět do inkubátoru
• Po cílené manipulaci (injikaci, implantaci,
transplantaci..) přelepíme otvor
a inkubujeme do odběru (D)
Nastavení stereoskopu
1. Vložit otevřené vajíčko ve stojánku(A)
pod preparační stereoskop (B)
2. Zaostřit pomocí velkého šroubu (C)
3. Nastavit osvětlení (D)
4. Dostatečně přiblížit pomocí malého
šroubu (E)
5. Opět doostřit pomocí velkého šroubu (C)
A
B
C
D
E
1. Otevření vajíčka
2. Určení stádia podle Hamburgera a Hamiltona
ocasní část
neurální trubice
vyvíjející se srdce
vyvíjející se mozek
allantois
končetinový pupen nohy
končetinový pupen křídla
oko
vyvíjející se mozek
oko
dolní končetina
horní končetina
HH 15
HH 20
HH 25
upraveno podle Warin S, 2009
Určení orgánů a stádia –
Hamburger a Hamilton
stádiování podle Viktora Hamburgera
a Howarda Hamiltona
publikováno v roce 1951
založeno na podrobném popisu
viditelných morfologických znaků
(orgány, počty somitů) a době vývoje
pro lepší pozorování je možno embrya
obarvit kapkou neutrální červeně
Implantace - postup
Implantace
• Do skořápky vystřihněte otvor, tak abyste
se dostali k embryu
• Odstraňte chorion a amnion nad místem
implantace (končetinový pupen nebo
postoptický region)
• Dbejte na jemnou manipulaci, aby
nedošlo k porušení žloutku, cév, nebo
zranění samotného embrya
• Pomocí pinzety přesuňte kuličku
z Petriho misky do vajíčka
• Proveďte vpich do tkáně pomocí jedné
plošky pinzety
• Uchopte kuličku opatrně pinzetou a
zanořte ji tak hluboko, až si budete jistí,
že je uvnitř tkáně
Po implantaci…
• došlo k úspěšné implantaci (kulička je ve tkánivhodné
zkontrolovat např. druhý den)
• vajíčko se přelepí průhlednou lepicí páskou
• vajíčko tužkou popíšeme!
• vajíčko se uloží zpět do líhně (37,8 oC)
• po požadované době inkubace otevření vajíčka
• kontrola fenotypu embrya
• následné zpracování cílové tkáně
Transplantace tkáně (chiméry)
• U jednoho embrya (po narušení membrán nad místem manipulace) odřízneme
horní končetinový pupen, přeneseme ho opatrně pomocí pasteurovy pipety
do druhého vajíčka
• U druhého embrya narušíme membrány nad místem transplantace, lehce
nařízneme povrchovou vrstvu tkáně a pomocí pinzety se snažíme končetinový
pupen dárce umístit do tohoto místa
1. 2.
Vyjmutí embrya z vajíčka
Nejdříve je nutné přerušit cévy a závěsy, posléze embryo vytáhnout
pomocí pinzet (když to nejde, výborně poslouží obyčejná plastová lžička)
Vyjmutí embrya slouží k:
• Použití embryonálních tkání ke kultivaci (tkání, nebo vytvoření primární
buněčné linie)
• Při ukončení experimentu je nutné embryo vyjmout a dále zpracovat
ovlivněné tkáně (histologie, izolace RNA pro stanovení exprese..)
Díky za pozornost