HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE I Histologie a embryologie Program 1. praktika • obecné informace (organizace výuky) • histologie a embryologie (co je předmětem studia) • zpracování tkání (laboratorní metody) • příprava histologických preparátů (demonstrace) Organizace praktik Začátek - přesně Přezouvání – vstup do mikroskopického sálu pouze v přezůvkách (ne v návlecích) Šatna Odložit svršky a zavazadla - zajistit doklady, cennosti, mobil Ztráty a nálezy – informace u dr. Daňkové Mobil – vypnutý nebo v tichém režimu Mikroskopický sál = laboratoř Zákaz konzumace jídla a nápojů v sále, Zákaz kouření na celé LF BOZP Pracovní místo zůstává stálé během semestru Student je osobně a hmotně odpovědný za poskytnuté pomůcky Průběh praktika - úvod – výklad + demonstrace - vlastní práce Samostatná práce studenta – studium preparátů ve světelném mikroskopu a fotografií v atlasu EM; jejich kreslení a popis = vyhotovení protokolu; protokol je na konci praktika zkontrolován. Student, který zjevně práci odbyl a tedy nebude mít vyučujícím podepsaný protokol, musí dané praktikum nahradit Student musí být připraven na dané praktikum Rozvrh a sylaby (programy) přednášek a praktických cvičení – viz nástěnka a interaktivní osnova předmětu Pomůcky (vlastní) sešit nebo volné papíry – formát A4, bez linek, dle šablony měkká tužka, pastelky Přestávka – 10 minut Konec praktika – vyhlásí vedoucí cvičení viz Interaktivní osnova předmětu Zápočet • 100% účast v praktických cvičeních • Kompletní sada protokolů podepsaných učitelem • Úspěšně absolvované průběžné testy • Během řádné semestrální výuky se studenti obracejí na vyučujícího své seminární skupiny. Jméno vyučujícího je uvedeno v rozvrhu, kontakt v IS. Pro neadresné dotazy je možné využít adresu: histology@med.muni.cz • Vyučující průběžně ověřuje znalosti a poskytuje zpětnou vazbu formou otázek, diskuze nebo testu. Obrázky jsou přístupné v MedAtlasu nebo v Interaktivních osnovách v ISu (popř. ve studijních materiálech). 100% účast • Všechna cvičení musí být nahrazená. Jednu absenci může omluvit vyučující (dle SŘU). Všechny ostatní absence musí být omluveny v IS. • V případě 4 a více omluvených a nahrazených absencí je možné získat zápočet pouze po úspěšném absolvování semestrálního testu. • Pokud student v důsledku vlastních absencí, byť omluvených a nahrazených, nepodstoupí minimálně 4 průběžné testy, bude jeho celkové hodnocení „x“ (nedostane zápočet) Nahrazování praktik Co udělat předem: • výjimečně, po předchozí domluvě se svým vyučujícím • nahrazování oznámit vedoucímu paralely (učitel zapsaný v rozvrhu jako první) • zapsat se do sešitu (před nebo po výkladu) • na konci praktika předložit vedoucímu praktika protokol k podpisu Co udělat poté: • absence musí být omluvena na studijním odd. a omluvenka zapsaná v IS Průběžné testování • Každý student je vyzkoušen 4x za semestr • Zkouší se písemně (malý test) zejména znalost základních struktury a jejich odborné (latinské) názvy na základě připravených obrázků. V případě neúspěchu je možná jedna oprava (1. opravný test), pro získání zápočtu je nutné splnit 4/4 nebo 4/5 testů. • Testy se mohou psát vždy jenom v řádném praktiku, nikoliv v náhradním • V případě neúspěchu u 2 nebo 3 testů následuje ve stejném zkouškovém období 2. opravný test (semestrální) pokrývající látku celého semestru • V případě neúspěchu u 4 testů je student hodnocen „X“ • Obrázky jsou přístupné v MedAtlasu nebo studijních materiálech praktik Doporučená literatura Ústav histologie a embryologie LF MU https://histology.med.muni.cz/ https://histology.med.muni.cz/cs/vyuka/elektronicke-studijni-materialy HistoKlub na Facebooku HISTOLOGIE nauka o stavbě normálních, tj. zdravých buněk, tkání a orgánů na mikroskopické a submikroskopické úrovni cytologie a obecná histologie speciální histologie = mikroskopická anatomie (stavba orgánů jednotlivých systémů) EMBRYOLOGIE – nauka o prenatálním (intrauterinním) vývoji jedince obecná embryologie (do konce 2. měsíce – EMBRYO - zárodek) od gametogeneze po raný embryonální vývoj speciální embryologie (od 3. měsíce do porodu – FETUS - plod) organogeneze (vývoj orgánů v jednotlivých systémech) teratologie – defektní vývoj orgánů (příčina, důsledek), vrozené vývojové vady (VVV = malformace = anomálie); metody prenatálního screeningu – ultrasonografie, amniocentéza, genetické vyšetření chromozomálních aberací (diagnostika, prevence a terapie). Histologie Rozlišovací schopnost oka: ~ 0,1 mm Rozlišovací schopnost SM: ~ 0,1 - 0,5 m Rozlišovací schopnost EM: ~ 0,1 - 1 nm Zpracování tkání a orgánů pro účely histologického vyšetření ve světelném mikroskopu (příprava trvalého histologického preparátu) • ODBĚR vzorků • FIXACE tkáňových bločků • PRANÍ • ZALÉVÁNÍ - (parafinové) bločky • KRÁJENÍ - řezy • NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů • BARVENÍ řezů • MONTOVÁNÍ (uzavírání) 1. ODBĚR MATERIÁLU malý kousek tkáně (orgánu) je odebrán a rychle vložen do fixačního media: biopsie z živého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr – stěr z povrchu sliznice) = excise (vyříznutí) = punkce (dutou jehlou – jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň) = kyretáž (např. endometrium) nekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře velikost odebraného vzorku 0,5 – 1 cm3, fixace následuje bezprostředně označení Pomůcky k odběru: kyreta trokar – dutá jehla s mandrenem 2. FIXACE Definice: denaturace a stabilizace proteinů v buňce („šetrné usmrcení buňky“ s minimem artefaktů) Důvod fixace: chemická nestabilita tkáně – vysoušení, svraštění, autolýza v důsledku působení bakterií, hypoxie. Fixace má předcházet těmto změnám a stabilizovat strukturu vzorku. Během fixace jsou proteiny konvertovány do inaktivní, denaturované formy. Požadavky na fixační činidlo: zachovat strukturu rychle penetrovat do tkáňového bločku neovlivňovat výsledek barvení Druhy: – fyzikální vysokou teplotou (var, žíhání nad plamenem), nízkou teplotou (lyofilizace, mrazová substituce – kryoprezervační látky) – chemická roztoky organických a anorganických látek imerze – ponoření do fixativa perfuze – promývání intravenózní aplikací fixativa CHEMICKÁ FIXACE Fixační činidla: organická – ALDEHYDY – formaldehyd (SM) – glutaraldehyd (EM) – ALKOHOL – 96 – 100 % (absolutní etanol) – ORGANICKÉ kyseliny – led. octová, pikrová, trichloroctová - anorganická – ANORGANICKÉ kys. – chromová, osmium tetraoxid (OsO4) – SOLI TĚŽKÝCH KOVŮ – HgCl2 - směsi: FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol) Postup: fixace – při pokojové teplotě, 12 – 24 hodin, vzorek musí být přelit 20 – 50násobným množstvím fixačního činidla: (1 cm3 : 20 – 50 cm3) 3. PRANÍ A ZALÉVÁNÍ odstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího media závisí na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%) důvod zalévání: „tvrzení“ měkkých tkáňových vzorků krájitelnými médii Zalévací média ve vodě rozpustná – želatina, celodal, vosky ve vodě nerozpustná – parafin, paraplast, celoidin Zalévání do parafinu dehydratace – odvodnění fixovaných vzorků (parafin se s vodou nemísí) vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96% každá lázeň alkoholu 2 – 6 hodin) projasnění – vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s parafinem – xylen infiltrace – rozpuštěným parafínem (bod tání 56C); provádí se v TERMOSTATU: parafinová lázeň – 3 x 6 hodin. vlastní zalití – do komůrek (plastové, papírové nebo kovové). Do komůrek se nalije rozpuštěný parafín a do něj se vloží tkáňové vzorky. Komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené vody. Parafinové bločky se po vynětí z komůrek zbaví přebytku parafínu a jsou připraveny ke krájení. odvodňovací tkáňový automat Leica TP 1020 Zalévací komůrky - papírové - kovové s orientačními plastovými prstenci výsledek zalití 4. KRÁJENÍ Mikrotom – regulace tloušťky řezů: optimum je 5 – 10 μm Sáňový mikrotom – blok je upevněný v držáku, nůž nebo břitva se pohybuje horizontálně Rotační mikrotom – nůž je fixní, držák s bločkem se pohybuje vertikálně Rotační mikrotom Sáňový mikrotom kryostat = rotační mikrotom v mrazicím boxu (– 60º C); zmrzlou tkáň lze krájet bez zalévání páska řezů parafinový bloček KRÁJENÍ 5. NAPÍNÁNÍ ŘEZŮ Napínání: na hladině teplé vody (45ºC) se řezy narovnají a vypnou Lepení: z vody jsou řezy přeneseny na podložní skla s adhezivním filmem (želatina nebo směs glycerin-bílek) a uloženy do termostatu (37º C). Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv. Např. parafin – deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylenem. 1 2 3 4 5 7 8 1 – odběr 2, 3 – fixace 4 – zalévání 5, 6 – krájení 7, 8 – napínání řezů 4 6 Napínání na teplé vodě Napínání na teplé podložce 6. BARVENÍ zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují afinitu k barvivům dvou skupin: zásaditá (bazická) barviva – př. Hematoxylin - reagují s kyselými strukturami (DNA v jádře aj.) bazofilie – bazofilní struktury kyselá barviva („cytoplazmatická“) – př. Eosin - reakce se zásaditými strukturami acidofilie – acidofilní (eosinofilní) struktury v buňce - chromofilní /chromatofilní/ x chromofobní - polychromatofilní – afinita k oběma druhům barviv ORTOCHROMAZIE - bunečné struktury se barví stejnou barvou, jakou má barvivo METACHROMAZIE - bunečné struktury se barví jinou barvou, jakou má barvivo Př. toluidinovou modří se v žírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a granula červenofialově (metachromaticky) Hematoxylin a eosin (HE) cytoplazma jádra xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace projasnění dehydratace praní barvení praní RUTINNÍ BARVENÍ: HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) Hematoxylin – zasaditý Eosin – kyselý Postup: Odstranění parafinu xylenem Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% 96% 80%) Barvení hematoxylinem  jádra - modro-fialová Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) Barvení eosinem  růžová - cytoplazma, vazivo, svaly Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% 96%) Projasnění v xylenu Haematoxylon campechianum Výsledky barvení: HE = Hematoxylin – Eosin jádra – modro - fialová cytoplazma a kolagenní vlákna – růžová svalová tkáň – červená HEŠ = Hematoxylin – Eosin – Šafrán kolagenní vlákna – žlutá AZAN = AZokarmín – Anilinová modř – oranž G jádra – červená erytrocyty – oranžové svalová tkáň – červená kolagenní vlákna – modrá řada boxů (kyvet) s barvicími médii MONTOVÁNÍ uzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem  trvalý preparát Montovací média rozpustná v xylenu – kanadský balzám rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma trvalé histologické preparáty ke studiu ve SM Hematoxylin a eosin (HE) ren Azokarmín a anilin. modř (AZAN) Barvicí metody: přehledné – HE, AZAN demonstrují všechny složky tkání speciální zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové složky impregnační soli Ag, Au nebo Os HE – nejpoužívanější barvení Zpracování tvrdých tkání (zub, kost) dekalcifikace (odvápňování) – převedení nerozpustných vápenatých solí do roztoku pomocí kys. mravenčí nebo chelatonu (EDTA), časově náročné – dny až týdny výbrusy – tenké ploténky (50 – 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním materiálu Histochemie & Imunohistochemie Význam: zjišťování povahy a lokalizace chemických látek v buňce „in situ“ (průkaz biomolekul - proteinů, AA, NA, sacharidů, lipidů, enzymů, pigmentů, anorg. látek – Fe, Ca, Zn aj.) Provedení: detekce Ag-Pl* komplexů nebo Ag-Pl + Pl* (sekundární značená Pl) * - marker 1. fluorochromy – rhodamin, Texas red, FITC 2. enzymy – křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza, 3. radioizotopy (I125) Antigen Primární Ab specifická vůči epitopu Ag Sekundární Ab specifická vůči primární Ab Enzym konjugovaný se sekundární Ab zajistí vizualizaci Aktin (cytoskelet) DAPI (jádro) Mikrotubuly (cytoskelet) KI-67 In-vivo/live cell imaging - US, MRI, PET… - Buňky s fluorescenčním reportérem doi:10.7150/thno.3694 - FACS ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ PRO ELEKTRONOVOU MIKROSKOPII (EM) Požadavky na pracovní podmínky: • pH všech roztoků (medií) 7,2 – 7,4 (pufry – kakodylátový nebo fosfátový) • bezprašnost • roztoky (media) – šetrné působení na tkáně (minimum artefaktů) POSTUP ODBĚR – okamžitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm3 FIXACE – glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO4 (vazba lipidů) – dvojitá fixace PRANÍ – destilovaná voda DEHYDRATACE - alkohol ZALÉVÁNÍ – vzorky se vkládají do želatinových kapslí nebo forem z plastu vyplněných zalévacím mediem (polymerizace – změna skupenství). Používají se epoxidové pryskyřice (Epon, Durcupan, Araldite) – ve vodě nerozpustná media Zalévací komůrky: želatinové (1), plastové (2) nosiče (držáky) kapslí (3) ploténky s komůrkami (4, 5) bločky připravené pro krájení 1 2 3 4,5 Odstranění přebytku tvrdého zalévacího media a zhotovení pyramidy s minimální řeznou plochou (0.1 mm2). Minimum tkáně (černý shluk) ve vrcholu pyramidy Úprava pyramidy (trimování) KRÁJENÍ po odstranění přebytku media (trimming) a vytvoření pyramidy se z malé plošky (0.1 mm2) krájí jednotlivé ultratenké řezy (70 – 100 nm) - ultramikrotomy používají se skleněné nebo diamantové nože s vaničkou – řezy splývají na hladinu vody ve vaničce a odtud jsou přeneseny na síťky (Ni) Ultramikrotomové nože: skleněný diamantový Krájení, nosné síťky Síťka se 3 páskami řezů typy sítěk KONTRASTOVÁNÍ princip diferenciace struktur – různý rozptyl svazku elektronů v závislosti denzitě struktur ; „elektronová barviva“ – směsi těžkých kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý Na kapce barviva je položena nosná síťka tak, aby ultratenké řezy byly vystaveny působení barviva. Rozdíly mezi SM a EM SM EM Odběr  1 cm3 minuty  1 mm3 sekundy Fixace formaldehyd 12 – 24 hod. glutaraldehyd 1 – 3 hod. Zalévání parafin epoxid. pryskyřice (Durcupan) Krájení Tloušťka řezů mikrotom 5 – 10 m ultramikrotom 50 – 100 nm Barvení (LM) Kontrastování (EM) barviva (hematoxylin – eosin) těžké kovy (uranylacetat, citrát Pb) Montování + --- Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka - elektronogram Otázky?