Izolace RNA
RNA je náchylná na degradaci ribonukleázami
- Inhibitory RNáz, sterilní boxy, DEPC-H20, rukavice!
Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly:-
, - Extrakce v guanidinových solích
- Fenolové extrakce při pH 5-6 (trizol)
- Odstranění DNA DNázami bez RNáz
- Selektivní srážení RNA pomocí LiCl
- Afinitní chromatografie na olido-dT kolonách pro izolaci mRNA
Izolace mRNA
• mRNA ty oři pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná""
• Pro izolaci se využívají
- Tradiční metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následně separovaná na mRNA, r RNA a tRNA
/
- Metody využívající afinitu poly (A) konce u mRNA a biotinem značené oligo(dT) sondy
Sonda se v lyzátu selektivně váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA
Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA j sou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem
Streptavidinem pokryte ^ Streptavidinem pokryte mikrozkumavky   s " maeneticke castice
Mix sample with fvsis buffer
Mix sample buffer solution with Biotin-labeled oltgrj (dTlg, pnotie, and incubate
Add 50 ul of mix to Streptavid in-coated PCAtube (immobilization occurs)
Wash 3 times with buffer
t Dlir\"£.li:d aii^o |dl:
Capturing an slrcplavidin-ataied i   : •;• i. partise
Magnet scparaiion
6
tMlOrl or fllKNA
o
a.
TTT
RNA separovaná na bioanalyzátoru Agilent
"TTT 4000
Vzorek RNA izolovaný TRIzolem po ošetření DNázou, RNA integrity number algoritmus pro posouzení integrity RIN = 8,8
Adsorpční metody
• Využívají schopnost nukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu křemičitého (kolonky do centrifugačních mikrozkumavek) v přítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979)
- guanidin thiokyanát
- guanidin hydrochlorid
• Síla vazby závisí na
- Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA)
- Iontové síle
- pH roztoku ^>
• Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant
• Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H20
• Rychlá metoda, vysoký výtěžek (malé fragmenty), vysoká čistota
Mechanismus interakce DNA s oxidem
křemičitým
Fig. 1
A possible mechanism for silica binding of DNA in high concentrations of chaotropic salt.
-OTltf^ Chactropii
Salt
CaNon "fi" DNA
/ rJ
i *
-ONg+0-P-0' 1
-O'N^O-P-0-
Base
B^ase Sugar
0
1
arte
N
- OH V
-0"No'0"-P-0'
Q Base o:Sugar
-0"No*0-P-0-i
O"
RNA Isolation Plasmid PCR Template Viral NA
Blood, Cells.    Isolation   Preparation    PCR      Isntaliun for
J Tissue. Bacteria. Bacterial   Blood Cells, Purification CRTQ-PCR
Yeast cells        Tissue   PCR Reaction Blood Seium.
Analýza a kvantifikace
SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA
- Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm
- Koncentraci stanovujeme na základě empirie:
A260	1.0 -	- 50	(xg/ml
DNA			
A260/A28O	1.6-	1.8	
A26O	1.0 •	« 40	MQ/ml
RNA			
A260/A280	-2.0		
- Vhodná metoda pro měření vzorků, které j sou
• V dostatečné koncentraci
• Dostatečně čisté bez významného množství kontaminant