Separační techniky nukleových kyselin • Metody – Elektromigrační – Centrifugační – Chromatografické • Vlastnosti využívané pro dělení biomakromolekul – Molekulová hmotnost – Konformace a tvar – Náboj – Hustota Metody elektroforetické • Princip – Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli – Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny • Cíl – Dělení molekul na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějím separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů Gelová elektroforéza • Základ • Z praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči • V případě nukleových kyselin bývá nosičem nejčastěji gel • Pro přípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají různou porozitu v závislosti na koncentraci gelu • Výhody • Elektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci • Aparatury jsou levné, často je lze vyrábět svépomocí • Dělit lze všechny důležité biomakromolekuly • Změnou podmínek lze dělit podle různých hledisek • Rychlost • Lze pracovat s mikrokvanty nebo preparativně v mikrogramových množstvích • Rozdělené molekuly lze snadno prokázat a ve funkční formě izolovat z gelu Používané nosiče • Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny – agarózou – polyakrylamidem • Vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry • Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru • Optimální velikost separovaných molekul – agarózové gely 100 bp až 50 000 bp – polyakrylamidové 10 až 1000 bp Uspořádání gelové elektroforézy • Horizontální • Vertikální + - +- Agarózové gely Koncentrace agarózy Rozsah dělení ds DNA 0,3 % 5 – 60 kb 0,6 % 1 – 20 kb 0,7 % 0,8 – 10 kb 0,9 % 0,5 – 7 kb 1,2 % 0,4 – 4 kb 1,5 % 0,2 – 3 kb 2,0 % 0,1 – 2 kb Separační schopnosti gelu v závislosti na koncentraci agarózy Příprava agarózového gelu Aparatura pro horizontální elektroforézu Elektroforetická pohyblivost DNA • Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. • Velikost fragmentu DNA o neznámé velikosti lze proto stanovit srovnáním jeho elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí fragmentů o známé velikosti, označovaných jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy. • Těmi bývají většinou restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním. Vztah mezi velikostí DNA a její elektroforetickou pohyblivostí v agarózovém gelu Aparatura pro vertikální elektroforézu Polyakrylamidové gely se připravují obtížněji než agarózové. Obvykle se lijí mezi dvě skla oddělená mezerníky. Příprava polyakrylamidových gelů • Složení: kopolymer akrylamidu a N,N,- metylenbisakrylamidu • Monomer je neurotoxin a mutagen • Katalyzátor – tetramethylethylendiamin (TEMED) • Iniciátor – persíran amonný (NH4)2S2O8 • Radikálová polymerace • V důsledku přítomnosti bifunkčního agens N,N,- metylenbisakrylamidu řetězce kroslinkují a vytvářejí gel Koncentrace polyakrylamidu v gelu Rozsah dělení dsDNA 3,5 % 1000 – 2000 bp 5,0 % 80 – 500 bp 8,0 % 60 – 400 bp 12,0 % 40 – 200 bp 15 % 25 – 150 bp 20 % 6 – 100 bp Separační schopnosti elektroforetických gelů v závislosti na koncentraci akrylamidu Polyakrylamid + Typy polyakrylamidových gelů • Nedenaturující gely – Gely pro separaci dvouřetězcových molekul v nativním stavu – Jsou používany pro separaci malých fragmentů dsDNA a heteroduplexů • Denaturující gely – Gely separující jednořetězce – Jsou používány při sekvencování • Denaturující gradientové gely – Fragmenty DNA se pohybují gelem, v němž se zvyšuje koncentrace denaturačního agens • Močovina • Formamid – Používají se pro separaci stejně dlouhých fragmentů lišících se svou sekvencí • Nanášecí pufry slouží při elektroforéze NA – Zvýšení hustoty vzorku - to umožní, že DNA klesne na dno jamky – Obarvení vzorku pro snadnější nanášení – Přidání pohyblivého barviva do vzorku pro možnost sledování průběhu elektroforézy • Rozdělení nanášecích pufrů – Založené na sacharóze – Založené na glycerolu – Založené na Ficollu® – Kombinované – Alkalické Pufry pro nanášení vzorků Přehled pohyblivých barviv v nanášecích pufrech 0,5 – 1,4 % agaróza 4 % polyakryl- amid 6 % polyakryl- amid Xylencyanol 4 kb 170 bp 105 bp Bromfenolová modř 300 bp 40 bp 25 bp Oranž G 50 bp - - Bromkresolová zeleň Pouze pro alkalickou elektroforézu 100 bp Migrace barviv je více ovlivněna nábojem a pufrem než velikostí molekuly Používané elektroforetické pufry Pufr Zkratka Pracovní koncentrace Zásobní koncetrace Tris-acetátový TAE 1 : 0,04 M Tris-acetát 1 mM EDTA 50 Tris-fosfátový TPE 1 : 0,09 M Tris-fosfát 2 mM EDTA 10 Tris-borátový TBE 0,5 : 45 mM Tris-borát 1 mM EDTA 5 Alkalický 1 : 50 mM NaOH 1 mM EDTA 1 Tris-glycinový 1 : 25 mM Tris 250 mM glycin 0,1 % SDS 5 Provedení elektroforézy Shlédnout video: How To Load and Run Agarose Gel Electrophoresis (BioRad) https://www.youtube.com/watch?v=uAttNVEEEwY Konformace DNA ovlivňuje mobilitu v gelu Forma II Forma III Forma I Metody detekce • Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. • Molekuly DNA lze snadno zviditelnit – Přímým barvením vhodným barvivem • Nejjednodušší a nejlevnější • Barvivo se váže na DNA (interkalační nebo povrchové struktury) • Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů – Příklad: Spolehlivě detekovatelné množství DNA etidiumbromidem v proužku na gelu je 1-2 ng. Aby byl detekován fragment o velikosti 200 bp pocházející ze sekvence dlouhé 20 kb, musí být do jamky na gel naneseno 200 ng DNA. – Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA • Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence • Každý fragment má stejný počet konců, intenzita značky není závislá na délce fragmentu • Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky • Je citlivější než barvící metody, ovšem dražší – Hybridizací se značenou sondou Rozdělení barviv pro detekci nukleových kyselin • Klasická barviva NA – Interkalační fenantridinová barviva • Etidium bromid • Etidium homodimer • Propidium jodid – Indolová a imidazolová barviva vázající se na menší žlábek • DAPI • Hoechst (bis-benzimid) – Další barviva • Akridin oranž • 7-amino-aktinomycin D • Hydroxystilbamidin • LDS 751 – Nevyžadující detekci UV-světlem • Metylénová modř • Barvení stříbrem • Kyaninová barviva – Původní patentovaná • Pro barvení gelů – SYBR Gold – SYBR Green I a II – SYBR Safe • Pro kvantifikaci – EVA Green – PicoGreen – OliGreen – RiboGreen – Pro buňky impermeabilní s vysokou citlivostí • TOTO, TO-PRO a SYTOX – Pro buňky permeabilní • Cytologická barviva SYTO – Chemicky reaktivní SYBR barviva tvořící biokonjugáty Fenantridinová barviva – Etidium bromid • Interkalační barviva vázající se bez sekvenční specifity na nukleové kyseliny s četností 1 molekula na 4–5 bp DNA • Mutageny a karcinogeny • EtBr a PI se váže jak na DNA, tak na RNA • Po vytvoření komplexu EtBr-DNA je pozorována ~20 - 30 vyšší fluorescence • Citlivost 1-5 ng DNA, 5 ng RNA (254 nm) • Polyakrylamid zháší fluorescenci EtBr, není možné detekovat méně jak 10 ng DNA Etidium bromid (fenantridinium, 3,8-diamino -5-etyl-6-fenyl-bromid) Srovnání výsledků Amesova testu u EtBr a SYBR Agarózový gel obarvený etidiumbromidem pozorovaný pod UV-světlem • vysoká afinita k NA • 1000 vyšší fluorescence po vazbě na NA • 25 – 100 citlivější než EtBr • Vhodná pro ds DNA, ssDNA a RNA • 60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm) • mnohem méně mutagenní než EtBr Asymetrická kyaninová barviva - SYBR Green a SYBR Gold SYBR EtBr SYBR Green I SYBR Gold a. POPO-1 b. BOBO-1 c. YOYO-1 d. TOTO-1 e. JOJO-1 f. POPO-3 g. LOLO-1 h. BOBO-3 i. YOYO-3 j. TOTO-3 Citlivost 15 – 50 pg dsDNA (300 nm) TOTO-1 chinolinium, 1-1'-[1,3- propandiyl bis[(dimetyliminio)-3,1- propandiyl]]bis[4-[(3-metyl-2(3H)- benzotiazolyliden)metyl]] tetrajodid a b c d e f g h i j Dimerní kyaninová barviva s vysokou afinitou k NA Barvení stříbrem • Barvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr • Citlivost 100 pg DNA v PA • dsDNA, ssDNA i RNA • Lepší citlivost vykazuje u polyakrylamidových gelů než u agarózových • Barvení zahrnuje 3 kroky: – Fixace (metanol, ledová kyselina octová a glycerol) – Barvení (uhličitan sodný, dusičnan amonný, dusičnan stříbrný a kyselina wolframovokřemičitá) – Zastavení (ledová kyselina octová) Dokumentace • Používané vlnové délky UV-světla – 254 nm – 302 nm – 365 nm Pulzní gelová elektroforéza • Při konvenční gelové elektroforéze se molekuly DNA pohybují od katody k anodě přímočaře a plynule a rychlost pohybu je úměrná jejich velikosti. • Rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. • Tento princip separace se uplatňuje u molekul DNA do velikosti přibližně 50 kb. • Větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí a nerozdělí se. • K jejich separaci se využívá pulzní gelová elektroforéza. • Gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180 ) v časových intervalech periodicky mění. • Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. • Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. • Techniky pulzní elektroforézy se využívá k separaci neporušených molekul DNA (např. chromozomů kvasinek) nebo restrikčních fragmentů o velikosti několika megabází. Horní limit velikosti separovaných molekul je 6 000 – 10 000 kb. Základní termíny týkající se PFGE • Pulzní pole (pulsed field). Elektroforetický proces, který používá více než jedno elektrické pole, a ve kterém se elektrická pole střídavě aktivují. • Pulzní interval (switch interval, switch time, pulse time). Čas, po který je každé ze střídajících se elektrických polí aktivováno. • Reorientační úhel (reorientation angle). Úhel mezi dvěma střídajícimi se elektrickými poli, tj. úhel mezi různými směry, ve kterých molekuly DNA putují. • Homogenní pole (homogeneous field). Elektrické pole, které má uniformní potenciálové rozdíly po celém poli. Princip separace molekul v pulzním poli • A. Molekuly DNA o různých velikostech v prostředí bez elektrického pole • B. Separace molekul v konvenční gelové elektroforéze (molekuly o velikosti 50 - 500 kb se pohybují stejnou rychlostí) • C. Při pulzní elektroforéze je elektrické pole E1 přerušeno a nahrazeno polem E2 v jiném směru. Aby mohla DNA ve směru druhého pole migrovat, musí se nejdříve reorientovat ve směru u nového pole. Čím jsou molekuly větší, tím delší dobu spotřebují ke své reorientaci, a dochází tak ke zpomalení jejich pohybu. • Pokud jsou obě pole stejná (směr, napětí, pulzní časy), bude výsledná dráha pohybu přímá, složená z jednotlivých !cik-cak“ kroků. Pohyb DNA v agarózovém gelu při PFGE Označení systémů používaných pro pulzní elektroforézu • PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis • OFAGE Orthogonal Field Alteration Gel Electrophoresis • TAFE Transverse Alterating Field Electrophoresis • FIGE Field Inversion Gel Electrophoresis • CHEF Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis • RGE Rotating Gel Electrophoresis • ZIFE Zero-Integrated Field Electrophoresis • PHOGE Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis Součásti aparatury pro PFGE Používané standardy velikostí pro PFGE • Konkatemery plazmidů • Konkatemery DNA fága lambda – Velikost monomeru 48,5 kb • Makrorestrikční fragmenty bakteriálních genomů – Staphylococcus aureus – Escherichia coli • Chromozomy kvasinek – Saccharomyces cerevisiae (240-2200 Kb) – Schizosaccharomyces pombe (3,5-5,7 Mb) – Hansenula wingei (1,0-3,1 Mb) – Candida albicans (1,0-4,0 Mb) • Chromozomy Dictyostelium discodium (3,6-9,0 Mb) • Chromozomy Neurospora crrassa (4,0-10,3 Mb) 25-90 s 1 800 s 60-120 s Pulzní časy Příprava vzorků pro PFGE • Kultivace buněk do přesně stanovené hustoty • Smíchání buněk s roztavenou agarózou • Nalití směsi do malé formičky • lyze buněk v agarózových bločcích • deproteinace DNA • Štěpení restrikční endonukleázou, která štěpí s nízkou frekvencí (velikost fragmentů 50 - 10 000 kbp) • Pulzní elektroforéza • Barvení gelu v etidiumbromidu Kapilární gelová elektroforéza • CGE.AVI • Kapilární gelová elektroforéza (CGE) je proces umožnující elektroforetickou separaci nukleových kyselin na základě jejich velikosti. • CGE relativně malých fragmentů DNA se provádí v povrchově modifikovaných křemenných kapilárách. • Horní limit velikosti separovaných molekul je 50 kb. Použití kapilární gelové elektroforézy • Pro CGE jsou používány dva typa gelů: – relativně vysoce viskózní gely chemicky ukotvené na stěnu kapiláry (chemické gely) – roztoky polymerů s relativně nízkou viskozitou (fyzikální gely) • CE má následující využití v diagnostice na úrovni nukleových kyselin: – Kvalitativní a kvantitativní kontrola oligonukleotidů – Kvantifikace genové exprese – Detekce sond hybridizujících s DNA v kapiláře – Studium interakce DNA s proteiny – Genotypizace – Automatické sekvencování nukleových kyselin