Enzymy používané pro analýzu _nukleových kyselin_ - RNA enzymy \. J B. Podle typu reakce - enzymy syntetizuj ící NK (anabolické) = polymerázy - enzymy odbourávající NK (katabolické) = nukleázy - enzymy modifikuj ící NK - enzymy spojující molekuly NK = ligázy ROZDĚLENI A. Podle typu substrátu - DNA enzymy Enzymy syntetizující DNA syntetizovaná molekula matrice název enzymové třídy příklad zdrojový organismus DNA DNA DNA-polymerázy DNA-polymeráza I E. coli RNA Zpětné transkriptázy Zpětná transkriptáza AMV AMV (Virus ptačí myeloblastózy žádná Terminálni transferázy Terminálni transferáza Telecí brzlík Enzymy syntetizující RNA syntetizovaná molekula matrice název enzymové třídy příklad zdrojový organismus RNA DNA RNA-polymerázy RNA-polymeráza T3, T7, SP6 E. coli inf. fágem T3, T7, SP6 žádná Poly (A) polymerázy Poly (A) polymeráza 3 Katabolické enzymy degradující DNA rozkládaná molekula typ degradace název enzymové třídy specifita Příklad zdrojový organismus DNA od konců Exonukleázy ss Exonukleáza III E. coli ds Bal 31 Alteromonas espejiani uvnitř molekuly Endonukleázy ss SI nukleáza Aspergillus oryzae ds reštrikční endonukleázy bakterie DNáza I Hovězí Pankreas ss = single stranded ds = double stranded 4 Katabolické enzymy degradující RNA rozkládaná molekula typ degradace název enzymové třídy Příklad zdroj RNA od konců Exonukleázy Fosfodiesteráza Hadí jed uvnitř molekuly Endonukleázy Ribonukleáza A Hovězí pankreas Enzymy modifikující DNA typ enzymu příklad zdroj Metylázy dam-metyláza dcm-metyláza EcoRI-metyláza E. coli Kinázy T4-polynukleotid kináza E. coli inf. fágem T4 Fosfatázy BAP-fosfatáza bakterie ClP-fosfatáza Hovězí střevo Enzymy spojující molekuly DNA typ enzymu příklad zdroj ligázy T4-DNA-ligáza E. coli inf. fágem T4 7 Reštrikční endonukleázy (RE) "Video reštrikční endonukieáza a https://www.youtubexom/watch?v=937F0mIkjp8 ligáza > součást reštrikčné modifikačních systémů bakterií > omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech (např. fág namnožený v E.coli kmeni C nemůže účinně infikovat E.coli kmen K - degradace fágové DNA) > DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací > původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem Restrikce bakteriofága Chromosomal —T ' DNA V Phage Chromosomal DNA is protected by methylation Restriction endonuclease attacks incoming DNA / Degraded phage DNA Význam restrikčních endonukleáz • nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA • prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu • základ pro genové inženýrství 10 Vlastnosti RE • štěpí dvouřetězcové molekuly DNA ve specifických místech • většina RE rozeznává palindromy (obrácené repetice) • štěpí oba řetězce DNA • rozdělují se do tříd I, II, III a IV RE třídy II mají praktické využití • vážou se na specifické (4-6 pb) sekvence nukleotidů • katalyzují štěpení dvou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství • k štěpení dochází vždy ve stejném místě • štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA • rozeznávací sekvence maj í téměř vždy charakter obrácených opakování: stejná sekvence je štěpena ve stejném místě v obou řetězcích • molekulová hmotnost: 20.000 - 100.000 • kofaktor: pouze ATP Charakter cílových míst RE třídy II 5'... gaattc...3' 3'... cttaag...5' 5'... gaa ttc...3' 3'...ctt aag...5' 5ř... GAa| aag...3' i 3/ I I1 n 11 * ^ i I li 'l"i i f 111 11.11 vjJ i Restriction enzyme recognition sequences. are rotationally symmetric. not mirror symmetric 13 Orientace je důležitá 5 ... NGAATTCN... 3 ... NCTTAAGN... 5 ... NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... + EcoRI 5 ...NCTTAAGN... 3 ... NGAATTCN... + EcoRI + A/1II ... NCTTAAp -.— pAATTCN... -|GN... ... NCTTAAGN... ... NGAATTCN... (no digestion) ř ■: z •• * * ■; :• ■: :■ •: :■ ■: :■ í :■ ■: :• n ř < ř ■: :■ ■. ... NC ... NGAATTp pTTAAGN. -|GN (>■ >í>\>OHH> 14 Produkty štěpení RE tupé konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) ostré konce (po štěpení řetězců v různých místech, která j sou obvykle vzdálena 1 -4 nukleotidy) - 5'přečnívající - 3'přečnívající EcoRI □ 7 g a a □ 3' 5' □ □ [] j j: aag^d □ 4 1 5' 3' l: a a a a □ n □ g m □ 31 Psfl n r: gcág □ 3' 5' □ 3 □ ^ g a c g 1 emu 5' 3' □ ■ 11 5' Sticky ends 3' At g g c a IXX acq c E3 □ 5r 5 i. Smal I cccggg □ Í 3 5' 3' Siicky ends 3' 5' □ ■ m c c č 3' 31 1 5' 3* □ ^ q Q g - 5' 3' Blunt ends g g g r: n : i 16 Názvosloví RE např. EcoRI • 1. písmeno: počáteční písmeno jména rodu produkční bakterie • 2. a 3. písmeno: první dvě písmena jména druhu bakterie • označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) • římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z téže bakterie Examples of restriction endonucleases Enzyme Recognition site Number of bases Ends generated Original source of enzyme EcoKl G/AATTC 6 5' stickv Escherichia coli RY13 BamRl G/GATCC 6 5' stickv Bacillus amyloliquefaciens H BgM A/GATCT 6 5' sticky Bacillus glohigii Pstl CTGCA/G 6 3' sticky Providencia s tuartii Xmal C/CCGGG 6 5' sticky Xan th omo ruts malvacea rum Sma\ CCC/GGG 6 blunt Serratia marcescens SaißA GATC 4 5y stickv J Staphylococcus aureus 3A AM AG/CT 4 blunt Arthrobacter luteus Notl GC/GGCCGC 8 5' stickv Nocardia otitidis-caviarurn Pad TTAAT/TAA 8 3' sticky Pseudomon as alcaligenes Only one strand of the recognition site is shown, with a slash (/) showing the position of the cleavage site. All the examples shown are palindromic, so the sequence of the second strand, read as the reverse complement, and the position of the cleavage site, will be the same as that shown. Thus the reverse complement of 5'-GAATTC-3' is also 5'-GAATTC-3, and both strands arc cut by EcoKl between G and A, Jednotka RE množství RE, které kompletně rozštěpí 1 \xg DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí 19 Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí Number of restriction sites DNA Genome source size (kb) 4bp 6 bp 8 bp 1 pUC19 10 0-1 0-1 2 SV40 5 20 1 0-1 3 Bacteriophage X 48 190 12 0-1 4 Bacteriophage T4 165 660 40 2-3 5 Bacteria 4700 18400 1100 70 6 Yeast* 16000 62500 390Ó 250 7 Fruit fly* 120000 470000 30000 1800 8 Mammals* 3 000 000 11700000 730000 46000 + Haploid values (most somatic cells have twice as much DNA) Polymerázy • syntetizují nukleové kyseliny postupným doplňováním nukleotidů k 3'OH konci stávající molekuly nukleové kyseliny • není známá žádná polymeráza prodlužující 5 'konec DNA • matricí (templátem) je jednořetězcová DNA nebo RNA • polymerázy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce 21 Poly merače DNA 59—>39 New strand Template strand 5r end V and 5' end Sugar Phosphate ONA polymerase III Nucleoside triphosphate -\-~ Pyrophosphate enc* \ 2P, 5' end V end 5' end 22 DNA polymeráza I (Kornbergův enzym) zdroj - E. coli katalyzuje 3 různé reakce: 1. Polymerázová aktivita: Prodlužování polynukleotidového řetězce ve směru 5'- 3' - matrice je čtena ve směru 3'- 5' - tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3 'OH skupiny rostoucího řetězce a 5 T dNTP za tvorby pyrofosfátu - požadavek přítomnosti primem 23 2. DNA polvmeráza I (Kornbergův enzym) Exonukleázová aktivita - hydrolýza řetězce DNA v obou směrech 5' Template Mismatched M \ bases ^, Exonuclease hydrolysis site f -DNA polymerase I 3. Degradace DNA ve směru 5'-3'a současná syntéza degradovaného řetězce - oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo („proof-reading") - využití při značení DNA („nick translace) - exonukleázové aktivity mohou záviset na přítomnosti iontů Mg2+ nebo Mn2+ 24 The 3 Activities of a DNA Polymerase {A} S-+3DNAsynthesis 25 Klenowův fragment DNA polymerázy I • jeden ze dvou produktů proteolytického štěpení DNA polymerázy I subtilizinem • polymerázová aktivita 5'-3' • exonukleázováaktivita3'- 5' Využití: při značení DNA („fill-in" 3 'zkrácených konců a pomocí „random hexamers") • sekvenování DNA Sangerovou metodou • syntéza druhého řetězce cDNA 26 The structure of the Klenow fragment of DNAP I from E. coli (a) Template Thumb Polymerase active site Primer Terminálni transferáza katalyzuje přidání deoxynukleotidů k 3'OH konci molekul DNA substrátem jsou přečnívající, zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA nebo ssDNA nevyžaduje matrici ani primer zdroj: telecí brzlík využití: přidání homopolymerních konců k 3 'koncům DNA značení 3 'konců DNA Příklad reakce katalyzované terminálni deoxynukleotidyl transferázou X O H dGTP 3' í ■ l 3 □ 3 m 5' Terminal transferase 3' □ ľ G G G G G r 29 Výhody terminálni transferázy • možnost připojení dlouhých úseků komplementárních nukleotidů na 3 'koncích vektoru a insertu • velikost připojených úseků nemusí být stejná (pokud se jedná o úseky větší než 20 nukleotidů, jejich párování je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě) • v transformovaných buňkách se nespárované oblasti opraví reparačními mechanismy Připojení homopolymerních konců ke klonované DNA terminálni transferázou klortovany fragment 5' 3' dCTP 3' 5 S1V 3* 5' 3 (C)nCC- terminální II deoxynuklcotidyl-trfinsferáza d GTP 5' G připojení Lannealíng" f a) odstranžnf jednořetĚzcovy"ch konců éxonukkázou b) zaplnení mezer pomocí DNA-polymerázy c) kovalentní spojení DNA-[|gázoii Zpětná (reverzní) transkriptáza • RNA-dependentní DNA polymeráza • přepis genetické informace z RNA do DNA • požadována přítomnost primem a matrice • poskytuje v první fázi hybrid RNA/DNA, po odstranění rna působením hydroxidů nebo RNázy H lze zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA • syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA polymeráza I zdroj: retroviry M-MuLV (Moloney Murine Leukémia Virus) AMV (Avian Myeloblastosis Virus) RSV (Rous Sarcoma Virus) 32 Zpětná (reverzní) transkriptáza Aktivity: • polymerázová • 53 'exoribonukleázová • 35 'exoribonukleázová (RNázaH) Využití: • tvorba cDNA - specifická (primer oligo dT) - nespecifická (primer komplementární k 3'oblasti hledané mRNA) 33 Syntéza cDNA tkáň (např. mozková) lýze buněk a purifikace mRNA 5' mRNA 5' mRNA hybridizace s poly(T)-primerem vytvoření kopie pomocí reverzní transkriptázy cDNA užití alkalického roztoku pro odbourání RNA 3' -AAAAAAA TTTTTTT 3' 5' AAAAAAA TTTTTTT 3'-konec cDNA tvoří vlásenku -TTTTTTT 5" syntéza komplementárního DNA-řetězce s použitím DNA-polymerázy; spárovaný 3'- konec funguje jako primer 5' reakce s jednořetězcovou DNA-nukleázou štěpí vlásenku 5" 3' ____ 5" dvouřetězcová cDNA je kopií původní mRNA 34 DNA ligázy • enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby mezi 5'fosfátovou skupinou jednoho řetězce a 3 'OH skupinou druhého řetězce za spotřeby ATP nebo NAD • fyziologický význam při replikaci, rekombinaci a reparaci DNA • analogické RNA ligázy katalyzují in vitro podobné reakce při ligaci ssRNA Působení DNA ligáz Nick I*' ■A -OH ^3' Nicked DNA Ligase-AMP —Ligase PPi ATP hOH n AMP □ Nicked DNA is joined Použití DNA ligáz • příprava rekombinantních molekul DNA • možno spojovat fragmenty DNA různého původu (reštrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.) 37 v r příprava rekombinantnich molekul dna Přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení fragmentů DNA pocházejících z různých zdrojů 51 Cut site t i 1 [] g 1 h □ ■ □ E3 C 3' c mm□mu a a g □ n 1 Cut site 5' rm □ ■ & G č ^ ■ □ □ c g m u a a řcoRI cut fragment from another source r □ o m □ G ^ □ □ □ Mix and anneai □ Sticky ends □ annealed ready for ligation 38 Běžné typy DNA ligáz T4-DNA-ligáza • izolace z buněk E.coli infikovaných fágem T4 • spojuje lepivé i tupé konce DNA • opravuje jednořetězcové zlomy („nicks") v dvouřetězcové DNAm RNA a u hybridů DNA/RNA • vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5'konci a OH skupiny na 3 'konci molekuly Bakteriální DNA ligáza • izolace z E. coli • spojuje jen DNA s lepivými konci 39 Nukleázy Nukleáza S1 • endonukleáza specifická pro jednořetězcovou DNA Zdroj: • bakterie Aspergillus oryzae Využití: • odstraňuje jedno vláknové struktury z DNA (odstranění nespárovaných smyček) • hydrolýzajednořetězcových konců 40 Mapování nukleázou SI CXO* i xniron exoff 1 rviRN/A -trans krťpt čtena tu race 7)ŕJA hybridise e £ ßMA £2 Hep en i nukleúZott elektrodové 2 a VÄVV Nukleázy DNázal • nespecifická deoxyribonukleáza • substrátem j e dvouřetězcová i j ednořetězcová DNA • za přítomnosti kofaktoru Mg2+ jsou místa štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích • za přítomnosti kofaktoru Mn2+ jsou přednostně štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě Zdroj: hovězí pankreas Využití: • nízké koncentrace: vytváření jednořetězcových zlomů v ds DNA • vyšší koncentrace: odbourání DNA z roztoků RNA 42 Ribonukleázy Ribonukleáza A • nespecifická ribonukleáza Zdroj: hovězí pankreas Využití: • odbourání RNA z roztoků DNA Ribonukleáza H • sekvenčně specifická ribonukleáza, rozpoznávající hybridní molekuly RNA: DNA 43 Působení enzymů používaných při manipulaci s DNA £ P Terminál trasferáza {dNTP) : í I I Z1 dsDNA DNA (ATP) kináza Fosfatáza DHA-ligáza (ATP) *1 r> Endonukleáza - nespecifická - specifická Polymeráza | | Exonukleáza (dNTP) I i' DNáza I Mono- a oligonukleotidy 44