Hybridizace nukleových kyselin tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a alespoň částečně komplementárních molekul nukleových kyselin založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA specif ita párování mezi definovanou DNA (sondou) a zkoumaným vzorkem je základem mnoha metod (a) Nestabilní hybrid (b) Stabilní hybrid Krátké nekomplementární oblasti neovlivňují celkovou stabilitu (c) Hybrid DNA-RNA Ďenaturace a renaturace DNA pH dvojšroubovice DNA denaturace renaturací se obnoví na jednoduché řetězce dvojšroubovice DNA (po narušení nukleotidových (znovu se spojí nukleotidové páry) párů) © Espero Publishing, s.r.o. ■ oddělení plně komplementárních vláken DNA lze dosáhnout např. působením vysoké teploty (90-100°C)/ extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) ■ obnovení běžných podmínek umožňuje pozvolnou renaturaci Průběh denaturace i renaturace DNA lze sledovat spektrofotometricky teplota (°C) čas (min) Stanovení hodnoty Tm Teplota, při které dochází k denaturaci DNA závisí na obsahu guaninu a cytozinu v DNA. Cím více obsahuje G C-párů, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Rozmezí denaturačních teplot je zhruba 30 - 100 °C. Denaturaci DNA provází hyperchromní efekt, tj. dochází ke zvýšení absorbance ultrafialového světla. Hyperchromní efekt je způsoben rozpadem dvouřetězcových molekul DNA na molekuly jednořetězcové, které absorbují UV-záření silněji než molekuly dvouřetězcové. 260 a25 260 1.3 1,2 1,1 ^260 = a^sor^ance roztoku ONA při ř>25 °C. Veo Al2A = absorbance roztoku DNA pri t = 25 °C. Absorbance je stanovena při 260 nm. 50% molekul DNA zdenaturováno teplota roztoku DNA 25 30 40 50 60 + 70 30 90 Tm (oq Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se symbolem Tm. Tato teplota odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky. V definovaném roztoku např. piati, ze Odtud Tm =69.3 + 0.41(GC). GC= Tm -ggj 0.41 Monitorovaní teploty tání dsĎNA Teplota tání (denaturace) závisí na čtyřech hlavních faktorech: - obsahu GC (a AT) - koncentraci solí - délce sekvence - přítomnosti nesporovaných úseků Vyzkoušejte si hru DNA simulator na : https://aoiTi.iTch.io/dna-simulator Hybridizace molekul nukleových kyselin. Spojení částečně nebo úplně komplementárních DNA řetězců pocházejících z různých dvou řetězcových molekul DNA nebo podobně spojení DNA-řetězce s RNA řetězcem; oba procesy probíhají in vivo a mohou být navozeny in vitro. Hybridní molekuly DNA. Renaturované molekuly, v nichž se spojily řetězce pocházející z molekul DNA různých zdrojů. Homoduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou. Heteroduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou. 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' 3' CTAGCTAGCTAGCTAG 5' zvýšení teploty 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' + přidání 3' CTAGCTAGCCGGCTAG 5' ochlazení 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' 3' CTAGCTAGCCGGCTAG 5' Využití hybridizace nukleových kyselín i test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) - z toho lze vyvozovat stupeň příbuznost testovaných organismů testy genové exprese (hybridizovat mnohou i molekuly DNA a RNA) lokalizace genů na chromozomech (FISH - fluorescence in situ habridization) testy paternity, identifikace osob, atd. spojování fragmentů při klonování čipové technologie („microarrays") amplif ikace nukleových kyselin pomocí PCR (připojení primeru k templátu je rovněž typ hybridizační reakce) vyhledávání klonů nesoucích rekombinantní DNA Jakékoli další lokalizace podle komplementarity Analýza tání DNA (Melting analysis) - testování stability Různé možnosti uspořádání hybridizačních experimentu hybridizace nukleových kyselin in situ J Southernův přenos - DNA northernový přenos - RNA westernový přenos - proteiny ■ ■ Typy přenosu z gelu na membránu podle typu analyzovaných molekul ■ Southernuv přenos - DNA ■ northernový přenos - RNA ■ westernový přenos - proteiny ■ southwesternový přenos - proteiny vázající DNA (sondou je DNA) ■ northwesternový přenos - proteiny vázající RNA (sondou je RNA) Typický hybridizační experiment Southernuv přenos ■ technika vyvinuta E.M. Southernem ■ vlastní hybridizaci předchází elektrof oréza DNA a presávka (blotting) na pevnou podložku Bežne použití: ■ detekce prítomnosti určitých genů v buněčné DNA ■ sledovaní evoluční příbuznosti vzorku DNA z různých organismů Southernuv přenos - postup příprava a značení sondy rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou*, hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou na filtru odmytí nenavázané sondy detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiograf ie) Před přenosem na pevný podklad se provádí elektroforéza Q Príprava polotekutého agarózového gelu s jamkami pro vzorky DNA. nalévání rozvařené agarózy do utěsněné vaničky s hřebínkem umístěným ve správné pozici hřebínek agarózový gel lepicí páska (utěsňující okraje vaničky) Q Nanášení roztoku DNA do jamek v gelu. Q Odstranění hřebínku a těsnící pásky po té, co agaróza ztuhla, a umístění gelu do elektroforetické vany. elektroda z platinového drátku Připojení zdroje elektřiny a začátek elektroforézy. elektroda ^ Vyjmutí gelu z vaničky, obarvení etidiumbromidem a vyfotografování v UV světle. 1 2 3 4 5 6 7 8 stoh papírových ručníků neznačená DNA rozštěpená reštrikční \ nukleázou odstranění nitrocelulosového papíru s pevně navázanou DNA značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel mycí houba alkalický roztok ZNAČENA DNA-SONDA JE HYBRIDIZOVANA S ODDĚLENOU DNA ODDĚLENÉ FRAGMENTY DNA PŘENESENY NA N1TROCELULOSOVOU MEMBRÁNU FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ELEKTROFORÉZOU NAAGAROSOVÉM GELU BARVENÍ GELU, FOTOGRAFOVÁNÍ DEPURINACE (HCI, PRO DNA >15 Kb) DENATURACE (NaOH) NEUTRALIZACE (TRIS.HCI, V PŘÍPADĚ PUFRU SSC PRO PŘENOS) zalepený plastický sáček Přenos DNA z gelu na membránu a hybridizace se sondou označená DNA-sonda v pufru OZNAČENÁ DNA-SONDA HYBRIDIZOVANA S KOMPLEMENTÁRNÍMI PRUHY DNA JE ZVIDITELNĚNA AUTORADIOGRAFIÍ (E) proužky / značených ( standardů Espero Publishing, s.r.o. značené proužky z pokusu Southernuv přenos DNA obarvena autoradiogram etidium bromidem Typy sond ■ reštrikční fragmenty dvouřetězcové DNA ■ produkty PCR ■ mRNA izolovaná z buněk nebo tkání ■ RNA transkripty in vitro ■ syntetické oligonukleotidy Radioaktivní značení sond Izotop síry a fosforu lze využít při značení nukleových kyselin Adenosin 5'-[a-35S] thio trifosfát o ho—p—o OH OH OH Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem 0 0 0 II II II 0'-P-0-P-0-P-0—i o 1 t I o- O" O" Molekula DIG-dUTP lineární denaturovaná DNA .....................I I I I I náhodné hexanukleotidy ''III....... I I I I I I dATP, dCTP, dGTP, dTTP . + Dig-dUTPY Klenowova polymeráza syntéza značené Dig-dUTP DNA 11111111111' TT ............ I I I I I........ I hybridizace na filtru I detekce navázané sondy " konjugát ...... Neradioaktivní značení sond Dígoxíneninem Biotinem OH H Oigoxigenin HN NH X fluorescenčními značkami (fluorescein) Způsoby značení sond ■ prostřednictvím náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling") ■ posunem jednořetězcového zlomu („nick translation") ■ koncovým značením ■ značením vektoru s nakloňovanou sondou ■ značením transkriptů in vitro Značení DNA pomocí náhodných oligonukleotidu Random primer DNA labeling' ■ k ssĎNA se pridá směs hexanukleotidů o různých sekvencích ■ k těmto primerum připojuje DNA polymeráza značené nukleotidy ds DNA 5 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 3 .......................... 5 denaturace připojení náhodných hexanukleotidů 5 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 ...... MIMI I II I II 3 M M M M M M M M M M M M M 5 Klenowova polymeráza + a32P-dNTP u M M M I I I M M I I M M I I M M I 3 < iJJXLLLLLLL 11 I I I 111111 ^ I I I I I 111111 ^ 3 .......................... 5 využití naznačené DNA jako hybridizačních sond Značeni DNA posunem jednořetězcového zlomu Nick translation" vytvoření náhodných jednoretězcových zlomů ĎNázou I odstranění nukleotidů od místa zlomu DNA polymerázou I (exonukleázová aktivita 5' - 3') současné připojení značených nukleotidů k 3' konci zlomu 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' ds DNA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I .....................' 3' 5' DNáza I + Mg++ vytvoření ^ jednoretězcových zlomů 3' TTI I I I I I I I 11 I I I I I I I I I I 11 ........................ N V TT N DNA-pol I + a32P-dNTP (N) (nebo neradioaktivní ^ značení) 3' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ...................... posun zlomů, náhrada odstraněných nukleotidů T značená DNA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ...................... spojení T4-DNA-ligázou 5' 3' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ........................ Značení koncu fragmentu DNA a) značení 5'koncu v A , alkalická fosfatáza 1 /) i> T4-DNA-polynukleotid I Kľ_/^ kináza + 32pATP p^O OH l 31 oh Značení koncu DNA fragmentu b) značení 3' koncu P l^-C\k terminálni transferäza f q ^ Kp4 DNA polymeráza I (Klenow) - .r s"5 32PdNTP Detekce neradioaktivních značek nukleových kyselin K značení NK se používá napr. biotin-16-dUTP (analog TTP) Detekce DNA značené bio-dUTP 1. avidin (streptavidin) konjugovaný s alkalickou fosfatázou ■ chromogenní substrát (X-f osf át + NBT) ■ barevná reakce 2. avidin (streptavidin) konjugovaný s luciferázou ■ substrát (lucif erin) ■ emise světla - detekce luminometricky 3. avidin (streptavidin) konjugovaný s křenovou peroxidázou ■ substrát (luminol) ■ emise světla - detekce luminometricky DNA Detekce biotinu protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou (AP) Substrát pro AP: A) X-f osf át + NBT B) lumi-fosfát Enzymová reakce: odstranění fosfátové skupiny Detekce: A) po reakci s kyslíkem se produkt reakce zbarvuje B) emise světla, zachycení na filmu Hybridizační postup Prehybridizace - zabránení nespecifické vazbě sondy na membránu (Ďenhardtův roztok, BLOTTO, heparin, heterologní DNA) Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68°C nebo 42°C s formamidem) - lze volit různé podmínky („stringence") Promývání - odstranění nenavázané sondy (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) Detekce navázané sondy - autoradiograf ie - imunologická reakce - barvení (luminiscence, fluorescence) Tečková hybridizace („dot bloť%) Postup: ■ sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA ■ denaturace ■ naneseni vzorků DNA na podložku v podobě teček ■ hybridizace se sondou ■ hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, p-spektrometrem) Tečková hybridizace při analýze genové exprese Postup: ■ hybridizační sondy specifické pro jednotlivé geny se nanesou na membránu pomocí vakuového filtračního přístroje ■ membrána se vloží do hybridizačního roztoku obsahujícího molekuly RNA označené radioaktivním izotopem nebo fluorescenčním barvivem ■ vizualizace označené RNA navázané na sondy hybridizační sondy specifické pro jednotlivé geny 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O o ••••OO o o 11 o o OOOOOO o o 20 21 o o OOOOOO o o 30 31 o o 03««C0 o o 40 41 o o OOOOOO o o 50 51 o o OOOOOO o o 60 61 o o OOOOOO o o 70 71 o o OOOOOO o o 80 81 o o OOOOOO o o 90 91 o o OOOOOO o o 100 nylonová membrána nesoucí matrici 100 sond Hybridizace in situ ■ detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách radioaktivními nebo fluorescenčními sondami ■ kombinace hybridizace s mikroskopií Využití: ■ prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA) ■ lokalizace genů (sekvencí) na chromozomech (hybridizace jaderné DNA) Obvyklá fluorescenční barviva ■ fluorescein (zelená fluorescence) ■ rhodamin (Červená fluorescence) ■ kumarin (modrá fluorescence) Postup hybridizace in situ při studiu chromozómu príprava cytologického preparátu fixace objektu na podložním sklíčku inkubace za přítomnosti ribonukleázy a NaOH (degradace RNA a denaturace DNA, chromozómy se částečně rozbalí a odhalí tak struktury DNA běžně skryté uvnitř chromozómu) hybridizace se značenou sondou autoradiograf ie nebo stanovení fluorescence barvení preparátu světelná nebo fluorescenční mikroskopie (a) Lidské chromozomy v metafázi x"4 >1 * tí J 10 |jm (b) In situ hybridizace Podložní sklíčko s upevněnými buňkami Rozlišitelný profil proužků Chromozom 1 Rozvinuté jrfft chromozomy i) (J \ Použití Použít próbu, autoradiogram Body ukazují lokalizaci klonovaného genu na chromozomu tm O 5- A Použití hybridizace in situ pro detekci genu na chromosomech (FISH) Použito 6 různých sond pro analýzu lidského metafázního chromozomu 5. Každá sonda vytváří 2 tečky na každém chromozomu (v mitóze je DNA zreplikována, tj. chromozom je složen ze dvou chromatid). Využití hybridizačních technik v praxi Detekce rekombinantních klonu - bakteriálních - fagových Postup: ■ vysev na plotnu (100 -1000 CFU/PFU) ■ růst do přiměřené velikosti kolonií ■ přenos na 1 - 2 filtry ■ lýze bakterií denaturace DNA ■ hybridizace se sondou ■ autoradiograf ie ■ vyhledání odpovídajících kolonií (plak) obsahujících hledanou sekvenci DNA Detekce bakteriálního klonu nesoucího určitý fragment DNA kotouček savého papíru radioaktivně značená sonda DNA •v Petřino miska s bakteriálními koloniemi inkubace se sondou a promytí DNA navázaná na papír kolonie obsahující značený plasmid přiložení fotografického papíru na kolonie odloupnutí papíru z misky k pořízení repliky kolonií lýze bakterií a denaturace DNA v alkalickém prostředí poloha značených kolonií detegovaná autoradiografií Selektivní hybridizace restrikčních fragmentu (SRFH) ■ Základní metodické kroky při SRFH □ štěpení celkové chromozomální DNA restrikčním enzymem □ separace fragmentů pomocí elektroforézy □ přenos fragmentů z gelu na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu □ hybridizace DNA navázané na membráně s jednou nebo více značenými sondami homologickými se zkoumanými geny □ detekce navázané sondy ■ sondy značené radioizotopy + autoradiograf ie ■ sondy značené neradioaktivně (digoxigenin, biotin, fluorescein, atd.) a následná detekce zahrnující enzym (AP) a barvotvorný substrát nebo enzym a chemiluminiscenční substrát □ vyhodnocení RFLP Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP) Heterozygous parents Heterozygous and homozygous offspring Father A Mother Á1 Offspring #2 #3 #4 r Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči Princip selektivní hybridizace CP CD Cells I T DNA Restricted DNA treatment 32 Electrophoresis Gel --• P Labeled-rRNA ^^^\^_ Non radioactive —X^J^-^"^ Labeled-rRNA Membrane Blotting Membrane Probing II *Z " *" ■i Příklad hybridizace se sondou specifickou pro16S rDNA. Princip ribotypizace ■ Ribotypizace zahrnuje fingerprinting restrikčních fragmentů genomové DNA, které obsahují celý nebo část genu kódujícího 16S a 235 rRNA. ■ Hlavní výhody ribotypizace: □ Sekvence genů pro ribozomální RNA jsou velice konzervativní, proto pro ribotypizaci všech Eubakterií může být použita jediná sonda. □ Jelikož většina bakterií obsahuje několik ribozomálních operonů, získáme po hybridizaci dostatečné množství fragmentů umožňujícíci mezidruhové i vnitrodruhové odlišení kmenů. RiboPrinter™ System Work Flow - EXTERNAL TO RIBOPRINTER™ SYSTEM - Automatizace ribotypizace Sondy používané pro SRFH u eukaryot ■ Jednolokusové sondy □ Hybrjdizují k jedné hypcrvariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor o 1-2 proužcích □ Pro identifikační účely se používa směs („kokteil") jednolokusových sond □ Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy □ Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA ■ Mnoholokusové sondy □ Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností 100 -1000 v genomu □ Při Southernově hybridizaci se detekuje 20 - 30 proužků □ U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má společnou konvenční sekvenci □ Délka repeticí u každé z alel je polymorfní □ Pravděpodobnost, že 2 jedinci budou mít stejnou délku 1 repeticejDo štěpení restriktázou HinfL jeo0 25. Pokud uvažujeme 36 detekovatelných lokusů (proužků), je pravděpodobnost výskytu stejného vzoru 0,2536=10"22 □ Nevýhodou je vysoký nárok na množství DNA (250 ng) □ Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitu v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí GGAGGTGGGCAGGANG sekvence repetice VNTR Využití VNTR při přípravě profilu DNA r TV 1 I I I I I I I I I I I I I GGAGGTGGGGAGG ČČTČČÄČČ ČČŤČČ DNA od Johna Doe .-' DNA od Jima Doe lokus 1 VNTR lokus 2 VNTR lokus 3 VNTR A A I I I I A A .....~l T I I I I I I I I I I I I ľ t ) A A ( I I I I I ) A A ( I I I I I I ) A A ( I ! I I I I I ) A A M I I I I I I I I ) A A (.......I i -i páry > homologických -i chromozomů Legenda: A= cílové místo pro reštrikční enzym A A štěpení restríkčním enzymem a rozdělení fragmentů elektroforézou -7 počet kopií _5 repetitivní sekvence -4 -3 -2 výsledek Southernovy hybridizace Vytváření profilu DNA při identifikaci osob ■ založeno na predpokladu, že s výjimkou jednovaječných dvojčat neexistují dvě osoby s identickou sekvencí nukleotidů ■ lidský genom obsahuje mnoho rodin polymorfizmu DNA, které lze využít k vytváření profilu DNA (otisk, „DNA f ingerprint") ■ jde o krátké sekvence, které se vyskytují v podobě tandemových repeticí různé délky - tandemové repetice variabilního počtu (VNTR, variable number of tandem repeats) ■ profil DNA je specifický soubor pruhů získaných Southernovou hybridizací genomové DNA, která byla štěpena specifickým restrikčním enzymem ■ profil DNA lze připravit z minimálního množství krve, spermatu, vlasových nebo jiných buněk po amplif ikaci pomocí PCR Využití VNTR při testování otcovství ■ izolace DNA z buněk otce, matky a dítěte ■ štěpení DNA, elektroforéza, Southernův přenos ■ všechny pruhy v zobrazení profilu DNA dítěte by měly být přítomny v kombinaci profilů jeho rodičů ■ lze použít více sond Soudní vyšetřování vzorek krevní oběť skvrny podezřelí jedinci | | J__2__3_ ■ profil DNA se používá pro identifikaci zločinců od roku 1988 ■ biologické vzorky testovány v kriminalistice ■ pravděpodobnost shody profilů dvou různých osob je 1:109 ■ i Sledovaní nukleových kyselin elektronovou mikroskopií Vacuum chamber Sample Screen Electron source Beam of electrons Electromagnetic ■ paprsek elektronů má menší vlnovou délku než viditelné světlo -proto má EM vyšší rozlišovací schopnost než světelná mikroskopie ■ zaostření paprsků elektronů je možné elektromagentickými čočkami (ne skleněnými) ■ materiály absorbující elektrony účinněji jsou ve výsledném obrazu tmavší Sledování nukleových kyselin elektronovou mikroskopií DNA molecules to be snadowed ■ neošetřené molekuly nukleových kyselin nelze pozorovat EM - úroveň absorpce elektronů je nízká ■ musí se nejprve pokrýt atomy kovu (zdrojem je kovové vlákno ze zlata, platiny nebo wof Iramu) Sledování hybridizace elektronovou mikroskopií ■ sledování hybridů ĎNA-RNA se používá pro studium přítomnosti intronů ■ počet a poloha smyček odpovídá počtu a poloze intronů Testovaní podobnosti DNA Species ADNA Species B DNA I Application of heat I breaks weak hydrogen bonds t t ^ 3 Mixing and cooling of strands allows bonds to form The more closely related the two X species are, the fewer mispairings in hybridization I ■ na základe hybridizace ĎNA-ĎNA ■ studium príbuznosti organismů - základ pro studium jejich evolučních vztahů, tvorbu fylogenetických stromů ■ otcem metody je Charles Sibley ■ touto metodou bylo zjištěno, že lidská a šimpanzí DNA je více příbuzná než vzhledem k DNA orangutanů a goril Common Pygmy Gibbon Orangutan Gorilla ohimp chimp Human Testovaní podobnosti DNA Htat OH . foímamidf Postup: ■ štepení DNA na malé fragmenty a jejich separace (denaturace) ■ smísení denaturovaných DNA ze srovnávaných vzorku (ľan dom dotl) Kíľidturdticn Hyniid ,:.n ion ■ renaiurace méně příbuzných řetězců nebude perfektní, stabilita hybridu bude odpovídat míře komplementarity řetězců - lze prověřit podle míry energie nutné pro jejich opětnou separaci ■ DNA hybridy příbuzných řetězců budou denaturovat při vyšších teplotách Profily tání („melting profiles") ■ DNA 1 se naváže filtr kolony ■ přidá se DNA 2, dojde k hybridizaci ■ směs se postupně zahřívá (teplota se zvyšuje po malých intervalech) ■ po každém intervalu se kolony promyje ■ fragmenty, které „roztají" se stanou jednořetězcovými a odmyjí se ■ teploty, při kterých se DNA odmyje, odrážejí míru podobnosti sekvencí DNA 2 pour through Hybridization occurs on filter