Polymerázová řetězová reakce (PCR) Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) ♦ Publikace ♦ Nobelova cena Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3*-OH-konce směřují proti sobě. PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. nature THEINTERNATIONAL WEEKLY JOURNAL OF SCIENCE [Explained and Nobel Prize rt ěm 1 PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: ♦ Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. ♦ K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. ♦ Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). Předpoklady pro zavedení PCR ♦ Syntéza oligonukleotidů ♦ Vlastní myšlenka (K. Mullis) ♦ Teplotně stabilní DNA polymeráza ♦ Automatické termocyklery 0ooo 1 Cyklus číslo Počet nově syntetizovaných molekul dsDNA při jednotlivých cyklech PCR 2n Počet nových dvou řetězcových molekul 1 3 7 15 31 63 127 255 511 1 023 2 047 4 095 8 191 16 383 32 767 65 535 131 071 262 143 524 287 1 048 575 2 097 151 4 194 303 8 388 607 16 777 215 33 554 431 67 108 863 134 217 727 268 435 455 536 870 911 1 073 741 823 Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů templát vedoucího řetězce 7«o sviraci nově syntetizovaný řetězec VEDOUCÍ ŘETĚZEC VÁZNOUCÍ ŘETĚZEC RNA-primer nový Okazakiho fragment DNA-polymeráza na vedoucím řetězci templát pro váznoucí řetězec DNA-polymeráza na váznoucím řetězci rodičovská DNA DNA-heiikáza primáza vazebný protein pro jednoduchý řetězec Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym Reakční směs obsahuje: ♦ Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). ♦ Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 jug genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. • Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. • Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+ • znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR ♦ Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery, vlasy, atd... Primery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10-30 nukleotidů. dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C. Taq Tth Tma Pfu Pwo Thermus aquaticus Thermus thermophilus Thermotoga maritima Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Syntéza obou řetězců u specifické sekvence 5' 3' T TGAGAAAGGAATAAGCAGAAT TCGT TCCAAAAAGAATGAGC TGT TGT TTGCAGAAATCGAGTATATGC AAC TC T T TCC T TAT TCGTC T TAAGCAAGGT T T T TC T TAC TCGACAACAAACGTC T T TAGC TCATATACG Přímý primer dNTPs 5' 3' * TTGAGAAAGGAATAAGC - DNAPOL -► AAC TC T T TCC T TAT TCGTC T TAAGCAAGGT T T T TC T TAC TCGACAACAAACGTC T T TAGC TCATATACG T TGAGAAAGGAATAAGCAGAAT TCGT TCCAAAAAGAATGAGC TGT TGT TTGCAGAAATCGAGTATATGC +-DNAPOL " TCTT TAGC TCATATACG ■ ^3' v dNTPs Zpětný primer T TGAGAAAGGAATAAGCAGAAT TCGT TCCAAAAAGAATGAGC TGT TGT TTGCAGAAATCGAGTATATGC AAC TC T T TCC T TAT TCGTC T TAAGCAAGGT T T T TC T TAC TCGACAACAAACGTC T T TAGC TCATATACG T TGAGAAAGGAATAAGCAGAAT TCGT TCCAAAAAGAATGAGC TGT TGT TTGCAGAAATCGAGTATATGC AAC TC T T TCC T TAT TCGTC T TAAGCAAGGT T T T TC T TAC TCGACAACAAACGTC T T TAGC TCATATACG / ZAHŘÁTÍ ^ K ODDĚLENÍ dvoušroubovice » ŘETĚZCŮ DNA \ HYBRIDIZACE PRIMERŮ T L +DNA polymerAZa +dATP +dGTP +dCTP +dTTP H L syntéza DNA z primerů 1. krok 2. krok první cyklus 3. krok (B) oddělení řetěxců DNA a přidání primem syntéza DNA oddělení řetězců DNA a svázání s primerem syntéza DNA oddělení řetězců DNA a svázání s primerem syntéza DNA \zzz L J DNA-oligonukleotidové primery oblast dvou řetězcové chromosomální DNA, kterou množíme první cyklus (tvorba dvou dvouřetězcových molekul DNA) / \ i—r 3=1 i—r IZÍSZ -LUZ JZD J X, I I JZD / JZD V druhý cyklus (tvorba čtyř dvouřetězcových molekul DNA) ých JZD JZD \ZZL \ZZL \ZZĽ ZZZ2 atd JZD třetí cyklus (tvorba osmi dvouřetězcových molekul DNA) REAKČNÍ PODMÍNKY PCR 1. Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 - 5 min / 95 °C. V prípade, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primem („self-priming") a možným falešným výsledkům. Vlastní řetězová reakce: 2. Denaturační krok (separace řetězců): 94 - 95 °C / 20 - 45 s, záleží na objemu reakce, tloušťce stěn zkumavek. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). 3. Připojení primem (55 - 65 °C / 30 - 90 s) teplota určuje specifičnost a 2Qx závisí na Tm primem a templátu. Pro oba primery by měla být Tm podobná. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužování primem (polymerační reakce) při standardní PCR probíhá při 72 °C /45 - 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. Cyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklérech, většinou se provádí 25 - 35 cyklů. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů. REAKČNÍ PODMÍNKY PCR Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) ^ Připojení primem na řetězce DNA S. X (30 - 65 °C, 1 min) >v Denaturace pro separaci \ řetězců DNA ^0 ~~ OD * (94 °C 30 s) Syntéza nových retezcu DNA polymerázou \^^^^^^^ (72 °C, 45s - 2 min) 10 KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PŘI STANDARNÍ PCR REAKCI ■ DNA. Pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: ♦ lidská genomová DNA: 100 - 500 ng ♦ bakteriální DNA: 1 - 10 ng ♦ plazmidová DNA: 0,1 - 1 ng ■ Primery. Sekvence a koncentrace primem významně ovlivňuje výsledek PCR. ♦ Optimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 |jM. ♦ U některých systémů může vyšší koncentrace (až 1 |jM) zlepšit výsledky ♦ Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primem a snížení výtěžku. ■ dNTP. Výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 - 500 |jM (pro každý nukleotid) ♦ Nejběžnější koncentrace dNTP je 200 |jM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. 11 ■ MgCI2. Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA. ♦ Pro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. ♦ Optimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM. ♦ Nejčastěji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 |jM dNTP). ■ DNA polymeráza. ♦ Obvyklá koncentrace je 0,5 - 2,5 jednotek / 50 |jl. ■ pH je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 - 9,0. ■ Přídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: ♦ albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 |jl) ♦ dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) - redukce nespecifické vazby primem ♦ detergenty (Triton X-100, Tween 20) ♦ betain (0,5 - 2 M) ♦ želatina ♦ glycerol (1 - 5 % v/v) ♦ spermidin ♦ protein 32 genu fága T4 ■ Minerální olej - zabraňuje vypařování během reakce 13 BEZCHYBNOST SYNTÉZY ■ Replikace s Taq DNA-polymerázou neprobíhá bezchybně, DNA-polymeráza příležitostně zařazuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementární) nukleotidy. ♦ Buňka má schopnost tyto báze odstraňovat opravnými mechanizmy. ♦ In vitro Taq DNA-polymeráze tato vlastnost chybí. ■ Frekvence chbného začleňování za podmínek amplifikace in vitro je asi 2x10-4. ■ Chybné začleňování je důležité, pokud jsou PCR produkty klonovány, neboť každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybně začleněné báze (mutace) potom obsahuje celé potomstvo. ■ Řešení problému: použití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna má opravné mechanizmy (proofreading). Stanovení teploty pro připojení primem ■ Teplota pro připojení primem (annealing temperature) zkr. Ta. Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primem a matricové DNA in vitro. Optimální teplota pro připojení primem při PCR se vypočítá podle vztahu: kde Tm Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a Tm Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: I T= 2(A+T) + 4(G+C) - 5 °C = Tm - 5 °C 16 NÁVRH PRIMERŮ PRO STANDARDNÍ PCR ♦ 18-25 bází dlouhé ♦ neobsahují vnitřní sekundární struktury ♦ obsahují 40 - 60 % G+C ♦ mají rovnoměrnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páry ♦ nejsou komplementární navzájem na 3'-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy ♦ na matricové DNA nemají falešná vazebná místa ♦ mají Tm teplotu 55 - 65 °C 17 příklady struktur vytvářených primery, které je nutné zohlednit při jejich návrhu ■ Chybně navržená dvojice primerů, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci: 5' ATTCAACCGTTCAAACAAGCCC 31 3' GTTCGGCCTACCTTTATTTCTC 5' Správně navržená dvojice primerů, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku: 18 Nesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy na tem plátové DNA: 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II I I I I I I I I I I I I 3'(948) tttcttacccttttt-tacc (966)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II II I II MIMI 3'(1191) tttgtattgcattatatacc (1210)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' I I I I I I I I I I I I 3'(395) tccatttttctttttatctt (414)5' Správně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: 5'(247E) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I M Ml 3'(787) taaatctatt agttt acacat aacc (811)5' 5'(247G) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I M I I I I I I 3'(3211) caattgtaact ataactgcgtt atc (3235)5' 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I I 3'(1194) gtattgcatt at atacctctgtt ag (1218)5' 5'(247G) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I M I I I I II I 3'(1 469) atattgta-tatacgaactaaatct (1492)5' Pro návrh primerů se obvykle používá specializovaný software (některý je volně dostupný na internetu). □ Melting Tempera ture [21 -mer] PUC19.SEQ Graph Zoom Options BRUSUHTUK &lmlKH»ľľ Dct display mode (2686) |pos:| 20 |Tm:| 64^~ 30 40 50 rCOCGCOTTTCOOTGRTGFICOOTGRRňfCCTCTGRCflCňTGCRGCTCCCGGRGRCGGTCI IGCGCGCRflRGCCflCTRCTGCCflCTTTtGGRGRCTGTGTRCGTCGRGGGCCTCTGCCRG -GTGTRCGTCGRGGGCCTCTGC SDTCSSRRRS Bar graph mode □ I Lower Primer False Priming Sites | □ B Lover Primer - Ml 3MP1 3:631 OL19 (positive strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 428 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3° I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3"(6328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5' Priming efficiency : 205 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3° I I I I I I I I I I I I I 3"(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5' Priming efficiency : 1 94 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3° II I I I I I I I I I I I I 3"(808) gtaatatggtcagtcctgc (790)5" Priming efficiency : 1 85 (above the threshold) 5 '(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3° III I I I I I I I I I I I 3-(5125) tclaaglggtcagtg-tgc (5108)5° Priming efficiency : 121 5 '(6328) GGTTTTC-CCRGTCRCGRCG (6310)3- I I I I I I I I I I I I I I 3 "(5989) aqaaaag tggtc-gctctgc (5971)5" Lover Primer - Ml 3MP1 8:631 0L19 (negative strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 76 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3° I I I I I I I Mil , 3"(5744) ccaaaaagcgggaaactgc (5762)5" □ I Current Ol i go i pČBIuj.seq Sequence Length : 1 042 Current Oligo (+ strand) 5- CCCGCCTGATGAATGCTCATC 3' Length: 5' Position: Tm: AG (25 °C): Degeneracy: P.E.*: 1/E: 21-mer 1373 72.1 °C -42.7 kcal/mol 1 492 5.30 nmol/A260 34.0 r*9/A2Ě0 Current Oligo (- strand) S' GATGAGCATTCATCAGGCGGG 3' P.E.*: 537 4.80 nmol/A2G0 31 .7 r*g/A260 /E: ! Selected Primers 1 pCBIu3.seq pCBIu3:2&9U21 Upper Primer 5' CGGCGCCAGATCTGGTACCCA 3' Length: 21-mer 5' Position: 269 Tm- 76.9 °C AG (25 °C) -46.1 kcal/mol Degeneracy 1 P.E.*: 542/542 1 /E: 5.1 2 nmol/A260 33.1 /*g/A260 pCBIu3:Q17L21 Lower Primer 5' TACCGGGTTGGACTCAAGACG 3' Length: 21 -mer 3' Position: 817 Tm: 69.5 °C AG (25 °C) -41.4 kcal/mol Degeneracy 1 P.E.*: 502/502 1 /E: 4.89 nmol/A260 32.0 /ig/A260 PCRI pCBlu.seq Optimal Annealing Temperature: 58.3° (Max: 72.0") Product Tm Primers Tn - Upper Primer Tn; difference: 15.S 7.6 Concentration Upper Primer 200.0 nM Lover Primer 200.0 nM Monovalent Cation 50.0 mM Free Mg[2+] 0.7 mM Terminal stability of the Lower Primer is too high. Position and Length Tm [°C] GC [98] P.E.» Product 1352 88.0 51 .3 Upper Primer 37 21 72.2 47.6 452 Lover Primer 1368 21 79.9 57.1 506 Total Ha[+] Equivalent: 155.8 „HOT START" PCR „Hot-starť PCR významně ovlivňuje specifičnost, citlivost a výtěžek reakce Princip: ♦ Při „hot-starť PCR jsou určité složky reakční směsi odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekročí optimální teplotu pro připojení primem (obvykle 55 °- 65 °C). ♦ DNA polymeráza je v této nekompletní reakční směsi nefunkční. ♦ Nedochází k prodlužování nespecificky navázaných primem během doby než je dosažena teplota Ta. 21 Separace důležitých složek reakční směsi je dosažena některým z následujících způsobů: ♦ Manuálně ♦ Některé složky jako DNA polymeráza nebo Mg2+ jsou vynechány v původní reakční směsi a přidány manuálně po dosažení teploty > 70 °C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta reprodukovatelnosti. ♦ Fyzikální separace ♦ Reakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí, které jsou odděleny bariérou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCI2). Během počáteční denaturace vosk roztaje a umožní smíchání reakčních složek. ♦ Protilátky proti DNA polymeráze ♦ Přídavek teplotně nestabilních protilátek umožní počáteční inaktivaci polymerázy. ♦ Chemická modifikace polymerázy ♦ Přídavek teplotně nestabilních látek, které se vážou na určité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom při pokojové teplotě inaktivní). K aktivaci enzymu dochází při počáteční denaturaci („FastStart Taq DNA polymeráza"). ♦ Další inhibitory ♦ např. oligonukleotidy specificky se vázající na polymerázu detekce amplifikovaného produktu pcr Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod UV světlem. Ověření specifičnosti produktů ■ Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) ■ Sekvencování Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2 - 4 = produkty PCR Detekce kvantitativní - v reálném čase 23 Kdy je primer ještě primerem? Kontaminace při PCR Vynikající citlivost PCR může být ovlivněna kontaminací i jedinou molekulou exogénni nebo neznámé DNA. Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledků je doporučeno: ♦ používání autoklávovaných roztoků ♦ fyzikální separace používaných PCR-reagencií od templátové DNA a PCR-produktů ♦ příprava reagencií i vzorků do alikvotních částí ♦ používání UV-světla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše ♦ používání jednorázových rukavic ♦ přidávání DNA do reakce jako poslední ♦ pečlivá volba pozitivních, negativních a vnitřních kontrol Vyloučení kontaminace je důležité zejména tam, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného produktu ♦ nízkokopiových templátů DNA ♦ degradovaných vzorků. V případě pochybností je nejlepším přístupem opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailům a kontrolám. Jako zdroj kontaminace DNA je nejčastěji uváděn: ♦ přenos kontaminující DNA z dříve amplifikovaných produktů PCR, ♦ vzájemná kontaminace zdrojových materiálů, ♦ kontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou sekvenci. Jako prevence před přenosem kontaminující DNA je v reakční směsi rutinně používána náhrada dTTP za dUTP. Následným působením uracil-N-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace. VYUŽITÍ METODY PCR 1. Základní výzkum 3. ♦ izolace genů nebo jejich částí ♦ sekvencování DNA ♦ mutageneza in vitro ♦ modifkace konců DNA ♦ analýza (selekce) klonů z genových knihoven ♦ příprava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum 4- ♦ prenatální diagnostika (dědičných chorob) ♦ detekce mutací v genech ♦ studium polymorfizmu genů (např. RAPD) ♦ populační genetika Využití v klinických disciplinách ♦ detekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) ♦ identifikace onkogenů ♦ typizace nádorů ♦ stanovení pohlaví Využití v praxi ♦ archeologie ♦ soudnictví ♦ kriminalistika 27 PCR amplifikace se používá k detekci bakteriálních a virových infekcí ■ Konvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti vypěstovat organismy v kultuře nebo detekovat jejich přítomnost v pacientu za použití protilátek. ♦ vyžaduje několik týdnů (mykobakterie) ♦ někdy metoda málo citlivá (protilátky) ■ Zvláštní význam má PCR při diagnostice virů, např. HIV. ♦ Cílem je detegovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk. ♦ Detekce odhalí HIV inkorporované v buňkách. Přítomnost virové RNA naznačuje aktivní infekci, a to lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátů vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk. ■ U tuberkulózy je pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů (sekvencí) mykobakterií pomocí primem připravených k těmto sekvencím. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen (druh). Tímto postupem je možno detekovat i jen 10 bacilů v 106 eukaryotických buněk. ^^^^^H PCR je používána k monitorování terapie rakoviny t(14;18) Nepřipojuje se k tomuto chromozomu 14q32 Nepřipojuje se k tomuto chromozomu Některé formy rakoviny vznikají jako výsledek chromozómových translokací týkajících se známých genů. Např. existuje translokace mezi chromozomy 14 a 18 u folikulárního lymfomu. Techniky PCR jsou schopny detekovat jedinou buňku z 106 normálních buněk, tedy daleko citlivěji než hybridizační metody. Dva PCR primery se vyberou ze sekvencí sousedících s místy zlomu na každém chromozomu. Pak pouze v buňkách, kde proběhla translokace, dojde k amplifikaci a vznikne fragment konstatní délky. Podobná strategie byla použita k detekci leukémií za použití mRNA jako výchozího materiálu. To má výhodu v tom, že mRNA představuje již amplifikační produkt daného genu genomové DNA. Jeden PCR produkt variabilní velikostí v každém cyklu PCR fragmenty s definovanou velikostí a exponenciálně se zvyšujícím počtem v každém cyklu Jeden PCR produkt variabilní velikostí v každém cyklu PCR je používána ke stanovení pohlaví u prenatálních buněk ■ Širokou oblastí využití PCR je prenatální diagnostika obecně. ■ Pro choroby děděné na X-chromozomum které postihují pouze samce, je stanovení pohlaví prvním krokem. To je možné proto, že samci nesou pouze jeden X a jeden Y chromozom, obsahující jedinečné sekvence. ■ Při oplození in vitro se odebere jedna buňka z rané zygoty pomocí mikromanipulátoru, vyizoluje se DNA a ta se popdorbí amplifikaci pomocí specifických primem. Prokáže se amplifikační fragment. Výsledku se pak využívá v genetickém poradenství při výběru samicích embryí pro implantaci. Odebrání oocytů po ovulaci Oplodnění in vitro ooo o o o Kultivace do 6.-10. buněčného dělení Odebrání 1 buňky z embrya J U U U M 9 1 2 3 4 5 ó Amplifikace Y-specifické sekvence ď 1 2 3 * 4 5 6 B Samčí specifický fragment Elektroforéza PCR produktů Analýza genové vazby s využitím jednotlivých spermií a) Polohy lokusu genu pro paratyroidní hormon (PTH) a lokusu Gg-globinového genu (HBG2) se nacházejí na krátkém rameni lidského chromozomu 11. b) Jednotlivé spermie se přenesou do zkumavek, amplifikace obou lokusů proběhne současně za použití dvou sad primem c) Reakční produkty se nanesou na nitrocelulózový filtr a jsou testovány próbami specifickými pro každou ze čtyř možných alel, A a a pro PTH a 6 a b pro HBG2. Výsledek hybridizace je vizualizována autoradiograficky. d) Z autoradiogramu lze odečíst haplotypy každé ze spermií, z nich pak vypočítat frekvenci rekombinace mezi oběma I lokusy a stanovit genetickou vzdálenost mezi nimi. HBG2 PTH \/ cue MDD Ch romosome 1 1 D [b) (c) Id) PTH HBG2 FACS (Fluorescence ^Activated Cell Sorter) \ y) Sperm number 1 • • 3 ■ 4 5 • • • • • 1 4 5 Ah AB oß Ab ab Take single sperm PCR amplify both PTH and HBG2 polymorphic sequences Spot products of PCRs on nitrocellulose and test with allele-specific probes Derive the haplotype of each sperm and calculate linkage between PTH and HBG2 Kvantitativní PCR (qPCR) Polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase (realtime PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative PCR, zkr. Q-PCR). Varianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR-produktu v reálném čase provádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje » cyklické střídání teplot ♦ detekci fluorescence » monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR-produkty elektroforeticky ■ lim Na DNA se vázající interkalační barviva ■ Pro kvantifikaci amplikonů se běžné používají fluorescenční kyaninová barviva SYBR® Green, která fluoreskuj! po vazbě na dsDNA. ■ Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1000 vyšší ■ Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR-produktu. ■ Signál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. ■ Na DNA se vázající barviva nemohou být použita u mnohonásobných reakcí ■ Hlavním omezením je nemožnost odlišení nespecifických produktů. ■ Nespecifické signály tvořené dimery primem mohou být zhášeny při použití primem značených specifickými fluorofory. 33 Kvantifikace prostřednictvím qPCR Fluorescenční výměny při qPCR Pro značení primem a hybridizačních sond se používají specifické molekuly fluoroforů ♦ emitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci světla odlišné vlnové délky ♦ emitovaná vlnová délka světla je vždy vyšší než absorbovaná Dvojitě fluorescenčně značené sondy obsahují kromě fluoroforů také zhášeč ♦ molekula, která přijímá energii z fluoroforů ve formě světla a způsobuje její rozptýlení ♦ ve formě světla s vyšší vlnovou délkou ♦ ve formě tepla ♦ k dosažení optimálního zhášení je třeba, aby se absorbční spektrum zhášeče překrývalo s emisním spektrem fluoroforů. V současné době existuje mnoho fluroforů určených pro jednobarevné nebo vícebarevné mnohonásobné detekce polymorfních sekvencí Jedna z nejčastěji používaných dvojic fluoroforů při metodách FRET ♦ donorový fluorofor FAM (6-karboxyfluorescein) ♦ akceptorový fluorofor TAMRA (5-karboxytetrametylrhodamin). TAMRA-dT TaqMan technologie Hybridizační metoda, Rj kterou využívá kvantita- B tivní PCR např. pro E detekci bodových mutací H Oligonukleotid s fluores- H cenční značkou B a zhášečem se váže Hj na vnitřní část amplifi- H kované sekvence ™ Pokud prime r vytváří homoduplex (a), je rozložen 5£-exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy a vznikne fluorescence TaqMan.exe Modifikace PCR používané při analýze genomu exp Připojení sel kace ostřei Cílová sekvence 5' 3' 3' 5' Denaturace j a připojení primerů 1 a 2 } 3 Primer 1 51 GCGC CrTAAGCCGG 5' Primer 2 31 3' l PCR H/ndlII 5' GCGCaWgCTT Target region 3' CGCGTTCGJAA Eco Rl gaattcggcc cttaíJgccgg Asymetrická PCR ■ Podobně jako jiné DNA, lze produkty PCR sekvencovat. ■ Templátem pro Sangerovu metodu jsou ssDNA. Pro jejich přípravu se používá se technika označovaná jako asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. ■ Standardní PCR se založí s tím rozdílem, že výchozí koncentrace primem se liší faktorem 100 (tj. jeden z primem je ve 100 x vyšší konectraci než druhý). ■ Dvouřetězcové DNA fragemnty se tvoří až do doby, než se jeden z primem nevyčerpá. ■ Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců - i když se tento tvoří spíše lineární než exponenciální rychlostí, je jeho množství postačující pro sekvencování. Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR) detekce sekvencí na RNA ■ RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR. ■ Produkty RT-PCR se tvoří, jestliže je izolovaná RNA nejdříve převedena na cDNA pomocí retrovirové zpětné transkriptázy ♦ M-MuLV = Moloney murine leukemia virus ♦ AMV = avian myeloblastosis virus a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. ■ Nevýhody: Zpětná transkriptáza je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42°C. Navíc v některých případech znemožňuje převod RNA na cDNA, zejména při složité sekundární struktuře RNA. ■ Současná technika: ♦ Termostabilní Tth DNA polymeráza z Thermus thermophilus]e schopná převést RNA na DNA (RNA dependentní DNA polymerázová aktivita) za přítomnosti Mn2+ iontů při 72°C. ♦ Pomocí stejného enzymu je poté prováděna PCR reakce. ■ Použití: ♦ mRNA ♦ virové genomy (např. hepatitis C virus, virus chřipky, pikornaviry) 41 Uspořádání RT-PCR reakce Jednokroková RT-PCR ■ Dvoukroková RT-PCR ♦ Tíh DNA polymeráza ♦ dvojice primerů ♦ syntéza cDNA za přítomnosti Mn2+ Výhody: ♦ rychlost ♦ není riziko kontaminace ♦ vyšší citlivost (probíhá při vyšší teplotě) ♦ První krok: zpětná transkriptáza + oligo(dT) ♦ Druhý krok: Taq DNA polymeráza + dvojice primerů Výhody: ♦ umožňuje optimalizovat zvlášť zpětnou transkripci a zvlášť PCR ♦ umožňuje syntézu dlouhých produktů (až 14 kb) Princip RT-PCR Návrh primerů pro RT-PCR ■ RT-PCR amplifikace mRNA vyžaduje dvojici specifických primerů. ■ Primery můžeme navrhnout tak, abychom odlišili produkty vznikací při RT-PCR a při standardní PCR s genomovou DNA. ■ Dva přístupy pro návrh primerů: ♦ Primery, které se připojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určitého intronu. Amplifikační produkt z genomové DNA je větší než produkt RT-PCR. ♦ Primery komplementární k sekvenci na spojení exon/exon. Takové primery neamplifikují genomovou DNA. 44