Klonování DNA Klonování: proces tvorby klonů Klon: soubor geneticky identických buněk (resp. organismů), odvozených ze společného předka Klonování DNA: tvorba klonů DNA Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, připravených např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo PCR (in vitro) Rekombinantní molekula DNA: molekula DNA vytvořená spojením cizorodé (klonované) DNA s klonovacím vektorem Objevitelé klonování Paul Berg - připravil první rekombinantní DNA viru SV40 a fága lambda, Nobelova cena za chemii Human cell DNA Plasmid DNA -I- o Bacterium Plasmid Klonování DNA Stěžejní metoda molekulární biologie: umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např. geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně zmnožit a zpřístupnit je tak dalšímu studiu Využití klonování DNA: • izolace genů • studium regulačních oblastí, které řídí genovou expresi • fyzikální a genetická analýza genomů • exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní exprese) za účelem přípravy žádaných produktů • základ genového inženýrství (alelická výměna, CRISPR/Cas editace, příprava transgenních organismů, genové terapie) 2 Klonování zahrnuje 3 kroky 1. příprava rekombinantní molekuly DNA 2. přenos rekombinantní molekuly do hostitelské buňky 3. Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA Pro zajištění bodu 2 jsou zapotřebí klonovací vektory 3 Klonovací vektory • nejčastěji kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace • obvykle odvozené z plazmidů nebo virů • navíc obsahují pomocné sekvence různého původu usnadňující vložení cizorodé DNA, její expresi, selekci transformantů, apod.) 4 Typy vektorů pro klonování DNA Plazmidové: pBR322, pUC 18, BACs Fágové: - odvozené od bakteriofága lambda - odvozené od fága M13 Kosmidy: hybridy mezi plazmidy a fágy Vektory eukaryotické buňky: - kvasinkové - rostlinné - živočišné Plazmidové vektory Vlastnosti: • Jednoduchá manipulace • Přirozený výskyt v mnoha druzích bakterií • Variabilita ve velikosti: jednotky kb - stovky kb (pro klonování obvykle malé 2-5 kb) AmpR Přirozené plazmidy • Extrachromozomální molekuly DNA, obvykle kruhové, dvouřetězcové a tvoří nadšroubovici • Schopnost replikace uvnitř bakterie, občasný přechod do jiné buňky) • Selekční výhoda poskytovaná plazmidem hostitelské buňce je zároveň výhodou pro plazmid • Zodpovídají za šíření genů pro rezistenci k antibiotikům • Je zakázáno provádět takové experimenty, které by mohly způsobit rozšíření nových genů pro rezistenci k antibiotikům v patogenních bakteriích 7 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1. Autonomní replikace v bakteriální buňce 2. Možnost tvorby více kopií v buňce 3. Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4. Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5. Přítomnost jednoho nebo více markem pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6. Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 8 Replikace plazmidů • Základní předpoklad pro využití plazmidů jako klonovacích systémů (namnožení fragmentu DNA) • Hostitelské buňka je vybavena veškerým aparátem pro replikaci DNA • Počátek replikace (orí) - genetická informace, kterou musí poskytnout plazmid, aby mohl být v bakteriální buňce replikován - Je tvořen jen několika stovkami párů bazí • Segregace do dceřiných buněk 9 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1. Autonomní replikace v bakteriální buňce 2. Možnost tvorby více kopií v buňce 3. Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4. Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5. Přítomnost jednoho nebo více markem pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6. Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 10 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1. Autonomní replikace v bakteriální buňce 2. Možnost tvorby více kopií v buňce 3. Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4. Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5. Přítomnost jednoho nebo více markem pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6. Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 11 Plazmidy a rozmezí hostitelů • některé plazmidy se replikují v rozmanitých bakteriálních druzích (široké rozmezí hostitelů): RP4, RSF1010, pC194 • většina vektorů užívaných pro klonování se replikuje jen v úzkém rozmezí hostitelů Výhoda: Nevýhoda: - snížení rizika rozšíření - pokud potřebujeme experimen-pozměněné genetické tovat s jinými bakteriemi než informace E. coli musíme si připravit „vlastní vektor" se specifickým ori • Pendlující (bifunkční, „shuttle") vektory - Možný přenos mezi dvěma bakteriálními druhy - 2 místa ori v jednom plazmidu 12 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1. Autonomní replikace v bakteriální buňce 2. Možnost tvorby více kopií v buňce 3. Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4. Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5. Přítomnost jednoho nebo více markem pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6. Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 13 Klonovací místo Unikátní reštrikční místo (zastoupené pouze jednou v molekule plazmidu) poloha klonovacího místa nesmí narušit funkci oblasti ori nebo j iné důležité funkce plazmidu začlenění fragmentu DNA do určitého klonovacího místa vede k vzniku rekombinantního plazmidu se dvěma cílovými místy téhož restrikčního enzymu - možno využít pro identifikaci rekombinantního plazmidu 14 DONOR VEKTOR (cizirodá DNA) restrikčníendonukleáza fragmenty DNA štěpený vektor (1 reštrikční místo) ligace rekombinantní DNA zavedení do recipienta I výběr klonů s rekombinantní DNA založení banky (knihovny) Místo „MCS" (Multiple cloning site) Krátká oblast DNA, která obsahuje cílová místa několika restrikčních enzymů je vytvořeno uměle (nasyntetizováno a včleněno do vektoru ligací) možno použít pro včlenění většího počtu sekvencí Hindm SptA Pst\ Sai\ Xba\ Sma\ Kpn\ Sst\ Ecafí\ bta - beta-lactamase (ampicillin resistance); selective marker ori= origin of replication facZ'= beta-galactosidase (partial gene) tact = repressor of fac promoter 16 Spojení fragmentů DNA prostřednictvím kohezních konců 5' Rozpoznávací místo pro EcoRl na vektoru ~l—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—T □ □■□GAAT T C □ ■ □ ■ □ C T T A A G □ □ □ □ _l_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_l_ 3' T 5" lepivé konce n—I—I—I—r □ □ ■ □ G □ ■□□CTTAA _l_I_I_I_I_I_I_I_L t—i—i—i—i—i—i—i—r A A T T C □ ■ □ ■ G □ □ □ □ J_I_I_I_L Fragment DNA z jiného zdroje vzniklý štěpením EcoRl AATTCBCDD G □ □ □ ■ Vytvoření směsi 1 1 1 1 □ □ ■ □ G A A T T C □ □ □ □ □ ■ □ □ 1 1 1 1 CTTAA ..... G □ □ □ ■ Lepivé konce vzájemně hybridizují a následně jsou kovalentně spojeny DNA-ligázou 17 Proces klonování • Geny (oblasti) zájmu jsou štěpeny RE • Vektor je štěpen stejnou RE • Klonovaný fragment je vložen do vektoru a spojen ligázou • Nový rekombinantní plazmid je vnesen do hostitelské buňky Recombinant DNA Molecule 18 Využití spojek a adaptorů Spojka obsahující rozpoznávací místo pro EcoRI 5'CCG^VATTCGG 3' 3'GGCTTAAGCC 5' Adaptor nesoucí kohezní konec pro BamH\ 5'OH-GATCCCCGGG-OH 3 3 GGGCCC-P [ ] dsDNA se zarovnanými konci T4-ligáza spojky EcoRI Klonování do místa EcoRI na vektoru HO ] dsDNA se zarovnanými konci adaptory T4-ligáza polynukleotidkináza ATP Klonování do místa SamHI na vektoru OH Využití rekombinací • Rekombinační klonování pomocí Gateway technologie • Funguje na principu reversibilní rekombinační reakce • Nejsou zapotřebí restrikční enzymy Další metody tvorby rekombinantní DNA bez využití klasických restriktáz • Homopolymerní konce (terminálni transferáza) • Golden gate klonování (endonukleázy štěpící v sousedství rozpoznávacího místa) • TOPO klonování (sekvenčně specifická topoizomeráza I z Vaccinia viru) • SLIC klonování (T4 DNA polymeráza) • Gibson assembly (exonukleáza + polymeráza) • Gateway klonování (rekombináza) Přenos plazmidových vektorů do hostitelských buněk Transformace: • bakterie uvedeny do stavu kompetence (u E.coli působeních chloridu vápenatého za nízké teploty) • po přidání DNA a krátkém zahřátí na 42 °C) přechází transformující DNA do buněk Elektroporace: • buňky jsou vystaveny krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí - v buněčné stěně vznikají póry, kterýmiexogenní DNA vstupuje do buněk Transformace bakteriálních buněk • závislá na stavu kompetence buněk • u některých bakterií se stav kompetence objevuje přirozeně (S. pneumoniae) • u E.coli se připravuje uměle - promytím buněk ledovým CaCl2 - přidání DNA - mírný teplotní „šok" (2 min, 42°C) - krátká inkubace v růstovém médiu (zotavení bakterií, exprese selekčního markem) 23 Transformace tepelným šokem s využitím CaCl2 í=9 * Centrifúge í Resuspend bacterial ^ □qIIqT in CnC - i solution J i pi ľ.'ĺ] phase E. coli culture Plate on LB + ampiclllin Itŕ-IO0 ampr colonies. / ng DNA Chill on ice Hear shock 42 °C H?C bath A liquor competent cells \ \ \ \ .u .u Store at "SO °C amp' plasitiid DNA Chill on ice 24 Transformace bakterií elektroporací • Promytí buněk vodou (odmytí elektrolytů z růstového média) • krátký elektrický puls o vysokém napětí • dočasné otvory v buněčném obalu • vstup DNA do buňky 25 Transformace elektroporací n Centrifuge Resuspend bacterial" '' pellet in sterile H?0 V__J Centrifuge f RfrsuspEnrj bacterial" V pellet in sterile H20 Log phase E. coil culture Chill on Ice T Use competent ceIIs immediately arnpr plasrnid DNA Electroshock 1 10B-1010ampf col oni es y pg DNA Plata on LB + ampicillin 26 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1. Autonomní replikace v bakteriální buňce 2. Možnost tvorby více kopií v buňce 3. Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4. Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5. Přítomnost jednoho nebo více markem pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6. Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 27 Selekční markery • Nezbytné pro funkci vektoru • procesy ligace i transformace j sou málo účinné: max. 1% bakteriálních buněk (E.coli) DNA přijme, v praxi obvykle méně • nutnost zabránit v růstu netransformovaným buňkám • obvykle zajištěno genem, který hostitelským buňkám poskytne rezistenci na antibiotikum 28 Gen bia • kóduje enzym (3-laktamázu • p-laktamáza hydrolyzuje p-laktamová antibiotika (příbuzná penicilinu), např. ampicilin 29 Inzerční inaktivace • projev úspěšného začlenění fragmentu DNA do klonovacího místa na fenotypu transformovaných bakterií - klonovací místo je ve vektoru umístěno v genu zodpovědném za rezistenci hostitelské buňky k antibiotiku - inzerce klonované DNA způsobí ztrátu funkce tohoto genu - buňky nesoucí rekombinantní plazmid jsou k danému antibiotiku citlivé, buňky nesoucí prázdný vektor j sou rezistentní 30 Princip inzerční inaktivace CJoned fragrr.ent Kpn\ Sst\ FcoRI Gen lacZ byl přerušen začleněním klonovaného fragmentu DNA: na X-gal plotnách vzniknou bílé kolonie 31 Růst na selekčním médiu Vector religation Vector + insert ligation Insert self-ligation Amp+X-Gal plate Amp+X-Gal plate Amp+X-Gal plate Modro-bílý test • Modré kolonie reprezentují ampicilin-rezistentní bakterie obsahující plazmidový vektor a exprimuiící funkční alfa fragment z intaktní LacZ alfa kódující sekvence. o [BíOé Moddd© reprezentují ampicilin-rezistentní bakterie obsahující plazmidový vektor s inzertem a exprimuiící nefunkční alfa fragment LacZ 33 Výhody inzerční inaktivace Jednoduše poskytuje informace o úspěšnosti ligace: • bakterie přijala plazmid (je AmpR) • bílá barva kolonie signalizuje, že přijatý plazmid nevznikl recirkularizací prázdného vektoru 34 Klonování v plazmidu pBR322 příklad inzerční inaktivace Psřl Štěpeni Psřl Přidání fragmentů cizorodé DNA připravených štěpením Psřl cizorodá DNA ■v Přenos do buněk E. coli Vysev na plotnu s tetracyklinem Přerazítkování na plotny s ampicilinem Přenesené buňky obsahující rekombinantní plazmid nerostou a nevytvoří kolonie Vyrostou kolonie z buněk, do nichž byl přenesen plazmid Založení kultury z kolonií, které nevyrostly na půdě s ampicilinem Vektory pro speciální účely • expresní vektory: obsahují promotor, kterým lze zajistit produkci cizího proteinu v hostitelských buňkách (vhodné inducibilní systémy) • kyvadlové vektory: obsahují dva počátky replikace - možnost propagace ve dvou různých organismech (např. E. coli a B. subtilis) 36 Expresní vektory • Upraven nej en pro klonování DNA, ale také pro její expresi • Obsahují signály pro: - iniciaci transkripce (promotor) - iniciaci translace (vazebné místo pro ribozóm a startovní kodon) u translačních fúzních vektorů 37 2 typy expresních vektorů Promoter Your Gene 1. Transkripční fúzní vektor • Obsahuje promotor, translační signály musí poskytnout klonovaná DNA 2. Translační fúzní vektor • Obsahuje signály pro iniciaci transkripce i translace • Klonovaný fragment se začleňuje do kódující oblasti genu ve vektoru • Inzert musí respektovat ncoi c/catgg čtecí rámec Reštrikční endonukleázy obsahující ATG kodon Nde ca/tatg Modifikace konců DNA, expression cassete PCR (EC-PCR) Připojení sekvencí prostřednictvím 56-konců primerů Cílová sekvence 5' 3' 3' 5' Denaturace j a připojení primerů 1 a 2 } 3' 3 Primer 1 51 gcgc 0rtaagccqg 5' Primer 2 31 3' 5' l PCR H/ndlII 5' GCGCaWgCTT Target region 3' cgcgttcgjaa Eco Rl gaattcggcc cttaíJgccgg 5' „ sticky foot" 3' Přidávané sekvence - RE místa - Promotory - Terminátory - Translační signály 39 Potřebné regulační sekvence pro expresi fem gene _ 1 atatggtcagtgcatataaaatttgttatcattagagtaattaaaggtcatttaataacttttggaatca 70 71 attggaggttctcatBHttatcttttagtcaaaatagaagtcatagcttagaacaatctttaaaagaag 140 141 gatattcacaaatggctgatttaaatctctccctagcgaacgaagcttttccgatagagtgtgaagcatg 210 211 cgattgcaacgaaacatatttatcttctaattcaacgaatgaatcattagacgaggagatgtttatttag 280 2 81 cagatttatcaccagtacagggatctgaacaagggggagtcagacctgtagtcataattcaaaatgatac 350 351 tggtaataaatatagtcctacagttattgttgcggcaataactggtaggattaataaagcgaaaataccg 420 421 acacatgtagagattgaaaagaaaaagtataagttggataaagactcagttatattattagaacaaattc 490 491 gtacacttgataaaaaacgattgaaagaaaaactgacgtacttatccgatgataaaatgaaagaagtaga 560 561 taatgcactaatgattagtttagggctgaatgcagtagctcaccagaaaaattaggcgtctattatatgt 630 631 ai i i i icagagataaataaaatattgatataaaagacaataactttataataattataactatttctaaa 700 701 ttctgtacgaagaattttcttataaacaaagattttagcaaataccagttatgatattcatai i i i i i at 770 771 tataaaaggatgtcttaagi 1 i i i iaggctttaggtattccatcctaaagi i i i i i i iagcttaaaagta 840 841 tcatctacagcaaaattgcaaacgacaaaattgataagtgcaattaaataaatgttagtaagtgaatcat 910 911 aattatccttgcttaagcatttgctttgtaagggaagtgaggaggcaactaatcg 965 rsbU gene putative promotor putative RBS start stoj terminator Fágové vektory -odvozené od fága X Výhody: • rekombinantní DNA lze sbalit do kapsidů a přenést do hostitelských buněk infekcí (o několik řádů vyšší účinnost přenosu než při transformaci plazmidovou DNA) • v jedné zkumavce lze uchovávat ve formě fágových virionů celou genovou knihovnu (např. několi miliónů rekombinantních klonů) • vhodné pro klonování větších fragmentů DNA (výhodné pro tvorbu genových knihoven) Pozn: rekombinantní plazmidy s velkými inzerty jsou měně stabilní (nízká klonovací kapacita), transformace je méně účinná, nízký výtěžek při purifikaci z E. coli Vektory odvozené od fága X (85 genomová DNA vektor inzerciu částečné štěpení restriktázou spojení ligázou konkatemer ■> 37 - 52 kb <4- sbalovací extrakt obalování in vitro í) (f) (í) (í infekce buněk E. coli plaky obsahující fágové viriony s rekombinantní DNA 0°oO° substituční střední fragment ■> 37 -52 kb <- Umělý kvasinkový chromozom (YAC) • Obsahuje 2 kvasinkové telomery, které umožňují j eho udržování v kvasinkách j ako lineární strukturu • Centromera • Sekvence pro replikaci • Selektovatelné signální znaky • Replikuje se v buňkách E.coli i kvasinkách • Vhodné pro klonování velkých fragmentů DNA (0,2 - 2 Mb) 43 Umělý bakteriální chromozóm (BAC) • Bakteriální vektory s nižší klonovací kapacitou než YAC • BAC = vektor založený na F plazmidu, který pojme inserty až do velikosti 300 kb • Výrazně vyšší stabilita než YAC • Hojně používané u sekvenačních projektů 45 Vektory pro savčí buňky • Replikace extrachromozomálních elementů typu plazmidů je v savčích buňkách obtížná • Vektory s počátkem replikace viru SV40 se replikuj í epizomálně v některých savčích buňkách (např. buňky COS) • Většinou stabilní klony vznikaj í po začlenění DNA do chromozomu 46 Retro virové vektory • využití schopnosti retro virů zajistit integraci DNA do genomu • využití možnosti „trans" komplementace retrovirových funkcí defektním pomocným („helper") virem • Funkce, které nelze „trans" komplementovat, musí být přítomny na samotném vektoru (LTR a místo psí) 47 Klonovací kapacita vektorů: přehled Klonovací vektor Velikost inzertu Běžné plazmidové vektory 0-10 kb X Inzerční vektory 0-10 kb X Substituční vektory 9-23 kb Kosmidové vektory 30-44 kb BAC (umělý bakteriální chromozom) <300 kb YAC vektory (umělý kvasinkový chromozom) 0.2-2.0 Mb 48