Vybrané metody molekulární diagnostiky Molekulární diagnostika Genotypové metody • Výhodou genotypových metod oproti fenotypovým je - nezávislost na expresi specifických genů v umělém prostředí (laboratorní média) - genotypové znaky jsou na rozdíl od fenotypových (biotyp, sérotyp, antibiogram) relativně stálé - dávají reprodukovatelné výsledky analýz i za různých laboratorních podmínek - jsou rychlé - metody založené na chromozomální DNA mají na rozdíl od fenotypových metod 100% typovatelnost Hodnocení kvality typizačního systému • Typizační systém je charakterizován kritériemi - Typovatelnost - Reprodukovatelnost - Stálost - Rozlišovací síla - Epidemiologická shoda - Snadnost interpretace - Jednoduchost provedení Detekční amplifikační metody cílící na nukleové kyseliny Kvantitativní PCR (qPCR) Polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase (realtime PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative PCR, zkr. Q-PCR). Varianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR-produktu v reálném čase provádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu cyklické střídání teplot detekce fluorescence monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR-produkty elektroforeticky relativní nebo absolutní kvantifikace Fluorescenční barviva vázající se na DNA 1111111 m 11111111 ii .................................................... Denatu tmu* I................................. Anneal ♦.......»lllí».....».....>g Extend 11111111111111111111 Primer Primer dimers ♦.....♦ ♦.....♦......♦ PCR product Pro kvantifikaci amplikonů se běžné používají fluorescenční kyaninová barviva SYBR® Green, která fluoreskují po vazbě na dsDNA. Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1000 vyšší Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR-produktu. Signál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. Na DNA se vázající barviva nemohou být použita u mnohonásobných reakcí Hlavním omezením je nemožnost odlišení nespecifických produktů. Nespecifické signály tvořené dimery primem mohou být zhášeny při použití primem značených specifickými fluorofory. Kvantifikace prostřednictvím hodnoty Cq • Přes specifičnost primem dochází při qPCR ke vzniku značného množství fluorescence pozadí. • Zohlednění signálu pozadí umožňuje prahová čára a hodnota Cq. • Ct - threshold cycle • Cp - crossing point • Cq - quantification cycle Cp - číslo cyklu PCR, při kterém reakční křivka vašeho vzorku protíná prahovou čáru. Standardní přímka pro qPCR BawIFne 1 Number of Cycles TaqMan technologie - qPCR s detekcí prostřednictvím fluorescenčních sond • Hybridizační metoda, kterou využívá kvantitativní PCR např. pro detekci bodových mutací • Oligonukleotid s fluorescenční značkou a zhášečem se váže na vnitřní část amplifi-kované sekvence, poblíž jedno z primem • Pokud sonda vytváří homoduplex, je rozložena 5£-exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy a vznikne fluorescence Kontroly při PCR Bez templátu (NTC) Detekce dimerů primem Detekce kontaminace Bez polymerázy (NAC) Detekce degradace fluorescenčně značených oligo Bez reverzní transkriptázy Detekce přítomnosti genomové DNA Pozitívni Účel Endogénni Jiný cíl na analyzované DNA Kontrola kvality reagencií Kontrola nepřítomnosti inhibitorů Normalizace Exogénni Stejný cíl na ověřené DNA Kontrola kvality reagencií Pridaná (spiking) Kontrola nepřítomnosti inhibitorů Vyloučení falešných negativních výsledků Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Amplifikace za izotermických podmínek s vysokou specificitou a rychlostí Metoda využívá DNA polymerázu vytěsňující řetězec (Bsm, Bst) a sadu čtyř primem Primery rozpoznávají celkem šest odlišných sekvencí na cílové DNA LAMP iniciuje vnitřní primer obsahující cílové sense a antisense sekvence Následující syntéza s vnějším primerem vytěsňuje jednořetězcovou DNA Ta slouží jako templát pro syntézu DNA vnitřními a vnějšími primery, které hybridizují s druhým koncem, což vede k vytvoření smyčky Při následném cyklu LAMP hybridizuje jeden vnitřní primer se smyčkou a iniciuje syntézu vytěsněné DNA, čímž se získá původní DNA ve smyčce a nová DNA dvojnásobné délky Cyklická reakce pokračuje s akumulací 109 kopií cíle za méně než hodinu. Konečným produktem jsou DNA s několika obrácenými repeticemi a strukturou podobnou květáku s mnoha smyčkami Dna lze detekovat/kvantifikovat vhodným fluorescenčním barvivem httDs://academic.ouD.com/nar/article/28/12/e63/2359194 • Vnitřní primer FIP hybridizuje s F2c v cílové DNA a iniciuje syntézu komplementárních v l v O retezcu • Vnější primer F3, který je o několik bází kratší a nižší v koncentraci než FIP, pomalu hybridizuje s F3c v cílové DNA a iniciuje syntézu vytěsnění řetězce DNA a uvolňuje komplementární vlákno spojené s FIP, které může na jednom konci tvořit smyčkovou strukturu • Tato jednořetězcová DNA slouží jako templát pro syntézu DNA iniciované BIP a následnou syntézu DNA s přemístěním řetězce s primem B3 • Výsledkem je „dumb-bell" forma DNA, která se rychle amplifikuje v cyklické části reakce kdy vznikají jak původní kopie, tak násobně prodloužené formy Metody pro amplifikaci molekuly navázané sondy Alternativní metody pro detekci nízkého počtu molekul cílové sekvence využívající amplifikaci samotné sondy po vazbě na cílovou sekvenci. Ligázová řetězová reakce (Ligase chain reaction - LCR) • Amplifikace cílové sekvence pomocí ligázy je alternativní metoda pro amplifikaci oligonukleotidové sondy navázané na cílovou sekvenci využívající DNA ligázu. • Při LCR se nevytváří nové kopie cílové sekvence, proto se řadí do skupiny metod pro amplifikaci sondy. • Metoda využívá DNA ligázu ke spojení dvou párů komplementárních oligonukleotidových sond po jejich připojení na cílovou sekvenci. - Úspěšná ligace proběhne pouze při dokonalém párování 3' a 5' konců obou oligonukleotidových sond k cílové molekule. • Po proběhnutí první úspěšné ligace vzniká produkt, který napodobuje původní molekulu a slouží jako templát pro připojení zbývající dvojice oligonukleotidů a jejich ligaci. • Nevýhodou ligázové amplifikační reakce (LAR) je teplotní nestabilita DNA ligázy a nutnost přidávat ligázu po každé denaturaci. - V současnosti sepoužívá ternostabilní DNA ligáza z Thermus aquaticus, která je stabilní po mnoha cyklech denaturace (LCR). Ligázová řetězová reakce (LCR) Ligate, heat, anneal i r 111111 f 1111111 Etc. 8 copies Ligate, heat, anneal 2 copies 1111 n 1111 h n 4 copies Modifikace LCR • Využívají pouze jedné dvojice sousedících oligonukleotidů - ligázová detekční reakce (LDR) - oligonukleotidové ligační stanovení (OLA) • Lineární kinetika amplifikace • Může být i kvantitativní metodou • Ve spojení s analýzou produktů PCR, kde se dá očekávat dostatečné množství tem plátu, je OLA používáno jako účinný detekční systém bodových mutací (PCR-OLA). • Tento přístup nevyžaduje průkaz amplifikovaného produktu na elektroforéze Metody pro detekci polymorfizmu v genomech Přímé metody - podávají informaci o primární struktuře DNA/RNA - Sekvenovanf - Jednonukleotidove polymorfizmy Neprime metody: fingerprinting 1. RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 3. SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) 4. SSCP (Single-strand conformation polymorphism) Typů polymorfizmu je mnoho: Príklady dalších typů genetických polymorfizmu -rozmanitá terminologie a modifikace technik podle toho, co je cílem diagnostiky. Conserved DNA-Derived Polymorphism (CDDP), Inter-SINE amplified polymorphism (ISAP), Sequence specific amplified polymorphism (S-SAP), Intron length polymorphisms (ILPs), Inter small RNA polymorphism (iSNAP), Direct amplification of length polymorphisms (DALP), Promoter anchored amplified polymorphism (PAAP), Target region amplification polymorphism (TRAP), Conserved region amplification polymorphism (CoRAP), Start Codon Targeted Polymorphism (SCoTP)..... 1. RFLP Polymorfizmus délky restrikčních fragmentu (Restriction Fragment Length Polymorphism) Princip RFLP RFLP vzniká přestavbami sekvencí inzercemi delecemi substitucemi bazí uvnitř restrikčních mí izolace chromozomální A DNA -► B D '(D (C změny u 400 kb fragmentu: výsledné fragmenty: dráha: (kb) štěpení reštrikční endonukleázou ■5 'TO b >N N >o (U n E >o ■s OJ N E c □ 400 250+150 600 ABC .Q O LO d) ._ í£ (o d) (0 N S .E o 450 D 600 500 450 400 EZj 350 ® 250 200 150 100 _15 počet změn i i 0 .Q ±Ĺ O LO O (/) oj ro o/yt*tí>^J^yiC( \ □— 99 bf>-) m >'~tcr*>rto 1 L t tec ^-t^ T dcera. 5 I syn *f« bude idw Reštrikční analýza chromozomální DNA (REA) Nevýhodou RE analýzy celkové chromozomální DNA je velké množství vytvářených restriktů s podobnou pohyblivostí v tradičním agarózovém gelu. Výsledkem je spektrum pruhů vizuálně obtížně odlišitelných. Pro přesné vyhodnocení míry podobnosti spekter je nutné použít - densitometrické měření - korelační srovnání densitometrických křivek Analýzu zjednodušit hodnocením pouze • malých fragmentů 50-1000 bp (PAGE + barvení stříbrem) • velkých fragmentů 5 -15 kb (FIGE) Přes uvedené obtíže byla REA použita ke studiu příbuznosti u řady bakteriálních druhů Campylobacter, Legionella, Neisseria, Staphylococcus, streptokoky aj. Makrorestrikční analýza chromozomální DNA pomocí PFGE Metoda slouží pro stanovení RFLP genomové DNA při použití restrikčních endonukleáz, které štěpí DNA na < 30 místech. Vznikají velké fragmenty chromozomální DNA (10 -1000 kbp), které jsou separovány pulzní gelovou elektroforézou. Pro izolaci intaktní DNA není vhodná konvenční metoda, ale používá se specifický postup. lil. • t. Příklad pulzní gelové elektroforézy DNA různých kmenů Staphylococcus carnosus. Ribotypizace - selektivní hybridizace restrikčních fragmentů Ribotypizace zahrnuje fingerprinting restrikčních fragmentů genomové DNA, které obsahují celý nebo část genu kódujícího 16S a 23S rRNA. 11!«» Hlavní výhody ribotypizace: ^^^^ - Sekvence genů pro ribozomální RNA jsou konzervativní, proto pro ribotypizaci všech Eubakterií může být použita jediná sonda. - Jelikož většina bakterií obsahuje několik ribozomálních operonů, získáme po hybridizaci dostatečné množství fragmentů (signálů). Charakteristika bakteriálního rrn operonu • rRNA-operon (rrn operon) se vyskytuje na bakteriálním chromozómu v několika kopiích. Automatizace ribotypizace RiboPrinter™ System Work Flow EXTERNAL TO RIBOPRINTER™ SYSTEM - Selektivní hybridizace restrikčních fragmentů u eukaryot Jednolokusové sondy - Hybridizují k jedné hypervariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor ^^^E o 1-2 proužcích - Pro identifikační účely se používá směs („kokteil") Et^ř jednolokusových sond LJI^fc - Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy P^^F - Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA ^^^H Mnoholokusové sondy É^^H - Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností ^^^H 100 - 1000 v genomu ^1^1 - Při Southernově hybridizaci se detekuje 20 - 30 proužků ^^^H - U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má společnou konvenční sekvenci - Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitů v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí GGAGGTGGGCAGGANG Sondy z transponovatelných sekvencí - Transpozony - Retrotranspozony Sondy z dlouhých roztroušených elementů (LINEs) Sondy z krátkých roztroušených elementů (SINEs) STRs (short tandem repeats) tetranukleotidové \ \ X x í ^ i Si? Alelově specifická PCR (AS-PCR) Využití - Pro detekci bodových mutací v genomech - detekce homozygotního a heterozygotního stavu v klinických disciplínách Je prováděna ve dvou nebo více paralelních reakcích - V první reakci je horní primer komplementární ke standardní sekvenci - V další reakci k mutantní nebo polymorfní sekvenci - Spodní primer je v obou reakcích stejný Předpokládá se, že k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. Uvažujeme-li homozygotní stav, k amplifikaci bude docházet pouze v jedné reakci. Metoda byla popsána nezávisle pod různými označeními a využívá dva odlišné přístupy. - První přístup je založen na chybějící elongaci v důsledku chybného párování bází na 3'-konci primem. • amplifikaci nedostupný mutační systém (ARMS), • PCR-amplifikace specifických alel (PASA) • alelově specifická amplifikace (ASA). - Ve druhém přístupu se chybné párování nachází ve střední části sekvence primem a brání tak hybridizaci primem k cílovému místu v případě, že se v templátové DNA vyskytuje. • kompetitivní připojení oligonukleotidu (COP). Pro snazší odlišení heterozygotního stavu v jediné reakci je používána varianta označená jako PCR-amplifikace více specifických alel (PAMSA) nebo dvojitý ARMS. - Jeden z alelově-specifických primem obsahuje na 5'-konci přídatný úsek několika nekomplementárních nukleotidů, a tak mohou být amplifikační produkty obou alel rozlišeny na základě své délky. Metoda je obecně velmi citlivá na optimalizaci experimentálních podmínek reakce, zejména koncentrace jednotlivých reagentů a templátové DNA. Alelově specifická PCR Open transfer of 1st product to new tube Aerosol co ní ami nation 1st amplification 15-30 cycles 1st round product | Odstupňovaná (nested) PCR Při PCR pomocí vnějších a vnitřních primem se amplifikace provádí ve dvou krocích. Metoda má oproti standardní PCR velmi vysokou citlivost (nízká koncentrace templátu). Používají se 2 modifikace: - Dvoukroková__ • První kolo zahrnuje 15-30 cyklů amplifikace s jedním párem vnějších primem. • Potom je reakce převedena do druhé zkumavky a prováděna amplifikace zahrnující opět 15-30 cyklů s párem vnitřních primem. - Jed no kro ková • První kolo amplifikace s jedním párem primem se provádí při nestringentních podmínkách (nižší teplota pro připojení primem) s 10-15 cykly. • Následuje reamplifikace zahrnující 15-30 cyklů při stringentních podmínkách s vnitřními primery, při které se ověří specifita amplifikace z prvního kola. 2nd amplification 15-30 cycles 2nd rourtd product No product transfer 1st amplification Low annealing temp 2nd amplication High annealing temp CGCGCG GCGCGC GCGCGC CGCGCG Predominant 2nd round product CGCGCG GCGCGC GCGCGC CGCGCG 1st round products In situ PCR (PCR in situ, incell PCR) • Fixace buněk nebo tkáně -zachování morfologie (paraformaldehyd) • Permeabilizace - přístup PCR reagentů k N K (detergenty, proteázy) - průběh PCR - v buněčných suspenzích - v cytocentrifugačních preparátech - pod mikroskopickým sklem • Detekce intracelulárních produktů - PCR-/A7 situ hybridizace (ISH) - Imunochemicky (protilátky proti DIG-11-dUTP, fluorescein-dUTP, 3H-CTP) • In situ PCR má aplikace jak ve výzkumu, tak v diagnostice: - detekce virových nebo provirových NK (HIV, CMV, HBV, HSV-2) - chromozomální přeskupení, translokace, hledání jednokopiových genů - mapování nízkokopiových chromozomálních sekvencí v metafázických chromozomech - detekce nízkokopiových mRNAa virových RNA 2. AFLP Polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů (Amplified Fragment Length Polymorphism) Náhodně amplifikovaná DNA Náhodná amplifikace využívající jeden nebo více primerů s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA Vzniká více amplikonů s různou velikostí a rozdílným molárním množstvím, nevyžaduje se proto štěpení restrikčními endonukleázami Úspěšná, rychlá a jednoduchá technika pro DNA fingerprinting popsaná nezávisle pod různými označeními: AP-PCR (arbitrarily primed PCR fingerprinting) RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) DAF (DNA-amplified fingerprinting) MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling) PCR-mediated genotyping Princip metody: - Metoda používá obvykle jeden krátký primer (8 -10 bp nebo M13). Teplota pro připojení primem je nižší než teoretická hodnota Ta. - Za těchto podmínek dochází k nasedání primem s vysokou pravděpodobností na více místech na obou řetězcích chromozomální nebo plazmidové DNA. - Obvykle se vyskytne několik míst pro nasednutí primem na protilehlých řetězcích, která nejsou od sebe příliš vzdálená, a umožní vznik produktu. - Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou (max. 2000 bp). Náhodně amplifikovaná DNA • Použití: - Rychlá typizace většiny izolátů mikroorganizmů - Typizace genomové rostlinné DNA z různých kultivarů - Taxonomické studie a identifikační postupy - Analýza mikrosatelitů - AP-PCR může být kombinována s DGGE nebo SSCP analýzou. - Produkty AP-PCR slouží pro přípravu hybridizačních sond používaných při binární typizaci - Metoda má vyšší diskriminační schopnost než PCR 16S-23S mezerníkových oblastí, ale nižší než Rep-PCR. • Nevýhody: - Nízká reprodukovatelnost mezi laboratořemi. - Částečné zvýšení reprodukovatelnosti je možné provedením reakce s různým ředěním DNA. Výsledek ovlivňují plazmidy přítomné v izolované DNA. Náhodně amplifikovaná DNA (AP-PCR) Příklad elektroforézy s AP-PCR produkty Elektroforéza v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu — — A B C 1000 500 200 Primer (stejný primer použitý jako přímý i reverzní) Amplifikovaná oblast * : Nedochází k připojení primeru v důsledku mutace ftt : Inzerce 300 bp Interrepetitivní PCR Primery cílí na konce repetic a amplifikují oblasti mezi nimi 1 500 bp -> ...... S s 100 bp -> Chromozóm A Amplifikace Taq polymeráza Elektroforéza í> Chromozóm B 200 100 A/67-repeticemi, které jsou umístěny (orientovány) v opačných směrech. Tvoří se různý počet fragmentů lidské DNA v závislosti na velikosti lidské DNA v buněčné linii. Tato technika je často používána pro "odhalení" lidské DNA od ostatních DNA. Alu\-PCR Primer A 3' aacgtcactcggctctas' Cast Alu sekvence 5'... ttgcagtgagccgagat ... 3' jedinečná pro primáty 3f...aacgtcactcggctcta...5j Primer B 5' ttgcagtgagccgagat 3' amplifikace s primerem A a a | A/u*- 1 Atu+- 2 Atu 3 Alu+~ 4 Alu amplifikace s primerem B B B b 6 5' . . ttgcagtgagccgagat .. 3' . . aacgtcactcggctcta . . 5' ttgcagtgagccgagat 3' b '5 3' tagagccgactgacgtt 5' 5' .. . atctcggctcactcgaa ... 3' ^^^^^^^ 3' . . . tagagccgagtgacgtt ... 5' 3. SSLP (VNTR) Polymorfizmus délky jednoduchých repetitivních sekvencí (variabilní počet tandemových repetic) (Simple Sequence Length Polymorphism) Polymorfizmus délky jednoduchých repetitivních sekvencí (SSLP-PCR) • Jednoduché repetitivní sekvence (SSR) jsou tandemové repetice o délce 2 až 10 bp (např. mikrosatelity) přítomné v eukaryotických genomech s četností až 80. • V důsledku mutací nebo rekombinace se počet těchto repeticí může zvýšit nebo snížit. • Primery pro tuto metodu jsou navrhovány tak, aby se připojovaly oblastem ohraničujícím SSR. -Tyto ohraničující sekvence bývají konzervativní pouze v rámci druhu a proto je nutné navrhovat pro každý druh novou sadu primem. Příklad amplifikace mikrosatelitů ^ Struktura Jedinečné ohraničující oblasti . ■ Repetice (např. GÄ) ^ Počet repeticí je velice variabilní mezi jedinci Návrh pimerů (^^) komplementárních k ohraničujícím sekvencím Amplifikace repeticí pomocí PCR Multiplex PCR-SSLP Fluorescenční značení primem značeni prime l**i"Ěi|'š-i- = 'j5 ľM pro amplifikaci 3sí?^I:r=H!I^lMtI?!lš!SÍ!l!.i mikrosatelitů •* " _ . ____umožňuie . tSt.ief •í t »r"*!!*lti«i ______1%::---- ■ » umožňuje amplifikaci několika lokusů ,---* Příklad elektroforetogramu s výsledkem multiplex PCR s fluorescenčně značenými primery 5 results control _|n| 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4300 5000 5200 5400 5600 5300 6000 6200 6400 ■ i i i i i i i i i i i i i i i i 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 ü -I XY li 1 Jul □ □ 1B : A11P171-6 12-1B(S)93-12-10307... □□ □ H 1Y : A11 P171 -6 12-1 B(S) 93-12-10807... □ □ 1 G : A11 P171-6 12-16(8)93-12-10307 IR : A11P171-6 12-1BCS) 93-12-10307 Stanovení SSLP na automatickém sekvenátoru CODIS markery pro identifikaci u člověka The official order of the 13 core CODIS loci given within the CODIS system itself is: - CSF1PO - FGA - TH01 - TPOX - VWA - D3S1358 - D5S818 - D7S820 - D8S1179 - D13S317 - D16S539 - D18S51 - D21S11 Sometimes, the following two loci used more in Europe than America are added to make a standard 15: - D2S1338 - D19S433 Určení pohlaví pomocí analýzy DNA • PCR cílené pro unikátní oblasti chromozomu Y - Gen SRY (Sex-determining region) - Nevýhoda DNA XX je netypovatelná - Možné falešné výsledky při inhibici PCR • PCR genu pro amelogenin - Kóduje protein nacházející se v zubní sklovine - 1 kopie genu na obou pohlavních chromozomech - Amplifikována oblast s 6 bp delecí v genu na chr. X - Mužská DNA 2 různě velké produkty 106 a 112 bp, ženská DNA 1 produkt 106 bp 4. SSCP Polymorfizmus konformace jednoŕetézcú (Single-Strand Conformation Polymorphism) Princip metody SSCP - viz elektroforéza • zvýšení účinnosti SSCP se dosahuje různými modifikacemi: - RFLP-SSCP • přístup kombinující štěpení DNA restriktázami s následnou SSCP • vzdálenost polymorfizmu od konce fragmentu - Vazbou různých látek ovlivňujících elektroforetickou mobilitu ssDNA - RNA-SSCP Qe nutno připravit ssRNA transkripcí pomocí T7- nebo SP6-RNA polymerázy) • SSCP je vhodná pro analýzu mutací v prokaryotických (rDNA), eukaryotických a virových genomech • Homozygot ní DNA vytváří 2 elektroforetické formy • Heterozygotní DNA obsahující sekvence dvou různých alel vytváří 4 elektroforetické formy ds DNA (stejná velikost, odlišná sekvence) Jednonukleotidové polymorfizmy detekované speciálními metodami s vysokou rozlišovací schopností Jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) Variabilita v počtu kopií genů (CNV) Krátké inzerce a delece (indels) Schematické znázornění metod s vysokou rozlišovací schopností pro identifikaci polymorfizmu v genomech standardní typ mutam PCR produkt Enzymatické T^eslriktáza DNA polymeráza Konformační ss ds y-t-K DNA čipy RFLP AFLP sekvencování Reslrikční štěpení -cp— —S X^SCP CFLP ddF DGGE DSCA EMD HMA Ligace adaptoru ddNTP Kleauáza Ďipy pro m i ni se k věncování TjPjT|ľ Ďipy pro hybridizace 'l I I <; t PCR -1_ .... ^=-=-— i™ .....Jí J j Agarazova pAQE Denalurační Automafeované DHPLC gely PAGE \ Fluorescenční výměny^ / r" ASO Molekulární FRET signály 2 T ■3L sekvenačni zařízeni Hmotnostní Sekvenování DNA array speklromebie ria pevném podkladu Real-time PCR Aplikace sekvenování • Celogenomové (WGS) - Krátká čtení - Dlouhá čtení - Hybridní assembly umožňuje získat celé chromozomy Telomere-to-Telomere (T2T) • Celoexomové • Cílené - hotspot Cílené (hotspot) sekvenování • Co nás zajímá - Jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) - Variabilita v počtu kopií genů (CNV) - Krátké inzerce a delece (indels) • Nádorové nebo zakázkové genové panely - Identifikace genetických biomarkerů asociovaných s onemocněním - Charakterizace genetických asociací s určitým fenotypem, jako je reakce na lék - Genotypizace - Návrh genetických testů, například pro farmakogenomiku nebo onkológii Princip panelů pro hotspot sekvenování Plasma DNA Barcode- Mutation hotspot I PCR I Round 1 I PCR iRound 2 Multiplexed , pre amplification of 1 KRAS, EGFR &BRAF hot spots Nested PCR of single gene region using barcoded primers Batch sequencing of barcoded PCR amplicons from multiple samples B Sequence redundancy In hotspot region Forward 75 bp read GAAGCTT... CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGGGTA ... Sequencing adapter 3" .. .CGACCACCGCATCCGTTCTCACGGAACT .. .TTGATTCG Reverse 75 bp read 5' ; Sequencing primer Whole genome multi locus sequence typing (wgMLST) • Využití bioinformatických přístupů pro analýzu jednonukleotidových polymorfizmu - wgSNP - Whole genome SNP analysis - wgMLST-Whole genome MLST - cgMLST- Core genome MLST • Vysoké rozlišení, reproducibilní, hierarchická nomenklatura • Vyžaduje vývoj daatabází alel, výběr vhodných alel, výpočetně náročné Minisekvenování - stanovení SNP pomocí DNA čipu ............. Jednonukleotidové extenze SIMP-j (AA) SNP2(CG) SNPjfCC) iHřl Ml A QC CG GC GC III II III II ITT . PCR produkty C' + D NA- p o lyme ráza Směs a cen ých ddNTP SNPi SNP2 SNP3 ff -í f 'ff ff ff AA CG CC 1. varianta - Prodloužení primem vázaného na čipu Jeden primer pro každý SNP, který genotypizujeme je imobilizován na sklíčku. K čipu jsou přidány multiplex PCR produkty, 3' fluorescenčně značené ddNTPs a DNA-polymeráza. Proběhne prodloužení primem o jeden ddNTP a výsledek reakce je vyhodnocen. Pozice primem na čipu definuje, který SNP analyzujeme a fluorescence nukleotidu určuje genotyp příslušného SNP. 2. Varianta - Alelově specifické prodloužení primem > Na sklíčku jsou imobilizovány dva alelově-specifické primery s bází na 3'-konci komplementární k oběma možným variantám nukleotidů v každém SNP. > Produkty multiplex PCR jsou přepsány do mnoha kopií RNA pomocí RNA-polymerázy. > Molekuly RNA hybridizují k čipu a slouží jako templát pro prodloužení primem, které je katalyzované pomocí zpětné transkriptázy > Během zpětné transkripce jsou do každého produktu začleněny fluorescenčně značené dNTP > Pro homozygotní genotypy je signál tvořený pouze jedním ze dvou alelově-specifických primem kdežto u heterozygotních genotypů je signál tvořený oběma primery. Digitální PCR (dPCR) Vyvinuta z droplet digital PCR (emulzní) nanojamkové přepážky o počtu až 100.000 na destičku, do kterých je naplněna reakční směs cílové sekvence koncentrovány v izolovaných mikroreaktorech distribuce do mikroreaktorů snižuje kompetici templátu a umožňuje vyšší toleranci k inhibitorům přítomným ve absolutní kvantifikace copy number variation detekce SNP analýza exprese genů lil JI