Imunologie cvičení Buňky imunitního systému • • MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D. Příprava krevního roztěru (nátěru) Správně Příliš tlustý Moc krve Nerovnoměrný tah Třásla se ruka Krev se srážela Mastné sklíčko Barvení nátěrů •Standardním barvením pro krevní nátěry je tzv. panoptické barvení dle Pappenheima: •1. Celý nátěr na 3 minuty pokryjeme May-Grünwaldovým barvivem. •2. Opatrně přikapáváme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo nesmylo. Cílem je nechat působit takto naředěné barvivo (1:1) další 1 minutu. •3. Barvivo slijeme, můžeme opláchnout vodou. •4. Na nátěr naneseme Giemsa-Romanowského barvivo. Toto barvivo musí být před barvením vždy čerstvě naředěné přibližně 1:9 (na 10 ml destilované vody 10 - 15 kapek barviva). Necháme působit přibližně 15 minut (10 - 20 minut). •5. Barvivo slijeme a důkladně opláchneme pod tekoucí vodou. •6. Spodní stranu sklíčka očistíme utěrkou. •7. Je vhodné ihned zkontrolovat probarvenost krevních buněk a případně preparát ještě dobarvit. Barvení pomocí hotových barvicích sad •Výhody: •rychlé (cca 1 – 2 min) •roztoky již připraveny •vydrží dlouho (měsíce) •ze skladovat při pokojové teplotě •používají se opakovaně • •Nevýhody: •Neposkytují tak dobré výsledky jako klasické barvící techniky •Ve výzkumu nebo při hodnocení sporných patologických nálezu je lepší použít klasické techniky, přestože jsou časově náročnější Příklady barvících sad: Leukodif Diff-Quik Postup barvení : Nátěr musí být suchý 1.Fixační činidlo (metanol) 5 x 1 s 2.Eozin 5 x 1 s 3.Azur 5 x 1 s 4.Oplach (fosfátový pufr pH 7,4 nebo dest. voda) Mezi jednotlivými kroky neoplachujeme ani nesušíme, Na konci nechat zaschnout a pozorovat pod imerzí Vyhodnocování krevního nátěru • Pozorujeme zásadně pod imerzí • • Správná oblast pro hodnocení: kde se krvinky příliš nedotýkají, v této oblasti prohlížet preparát při tzv. meandrovitém pohybu (C) • Krevní diferenciál (dif): procentické zastoupení jednotlivých typů leukocytů • • Krevní obraz: kompletní hodnocení počtu a morfologie formovaných krevních elementů • Orientační pomůcka: na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů • Srovnání počtů leukocytů u různých tříd Granulocyty •Jádro segmentované • •V cytoplasmě mají granula: • •- specifická granula, barví se podle typu kyselými nebo bazickými komponentami barviv dle Pappenheima • •- azurofilní granula jsou považována za lyzozomy a barví se purpurově • •Neutrofil •velikost 10 – 12 μm, segmentů 2 – 7, Hynkovo číslo, posun doleva •hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza •1/3 granul azurofilních (primární lyzozomy), zbytek granula specifická •nízká úroveň proteosyntézy, glykogen v cytoplasmě - přežívá i v anaerobním prostředí •v oběhu žijí jen 6 – 7 hodin •Receptory: •Fc fragment IgG (FcγR) •C3b složku komplementu, složky komplementu C5a a C3a •TLR •hematopoetické stimulační faktory GM-CSF nebo G-CSF • • •Eozinofil • •velikost 12 – 14 μm, jádro ze dvou segmentů (brýlovité) •granula větší než u neutrofilů, barví se cihlově červeně. •hodně specifických granul (až 200), obsahují hlavní bazický protein (hodně argininu) •typicky se vyskytující v tkáních, v oběhu málo •schopny fagocytózy, význam v boji s endoparazity zejména mnohobuněčnými helminty • •Receptory: •Pro IgG a IgE označovaný FcεR, který existuje ve dvou formách podle afinity k IgE • Bazofil •velikost 9 - 11 μm, jádro protáhlé, často esovité, méně kondenzované •specifická granula tmavě modrá, překrývají jádro, obsahují heparin a histamin •v oběhu žijí většinou 1 den •účastní se alergických reakcí • Receptory: vysokoafinní FcεR Bazofily vykazují řadu podobností s žírnými buňkami, které se v minulosti označovaly jako tkáňové bazofily. Jedná se však o odlišné typy buněk, vzniklé z jiných prekurzorů kostní dřeně. Agranulocyty •Jádro není segmentované • •V cytoplasmě nemají granula • •Lymfocyt • •velikost 6 – 12 μm podle stupně zralost (malé střední a velké lymfocyty) •jádro kulaté a hodně tmavé •granula v cytoplasmě nejsou pouze drobná zrnitost •v nátěru se T a B lymfocyty jeví stejně, většina 75% v periferní krvi jsou T lymfocyty •v periferním oběhu převládají malé lymfocyty, které mají průměr 6 – 8 µm •většina lymfocytů žije několik měsíců. Paměťové buňky jsou schopny přežívat po celý život jedince •Receptory: •Specifické receptory pro antigen TcR a BcR •Monocyt • •velikost 14 – 20 μm jádro často ledvinovitého tvaru •cytoplazma obsahuje jemná azurofilní granula (lyzozomy), specifická granula zde nejsou •poločas setrvání monocytů v krvi je 12 – 100 hodin, poté zpravidla pronikají do tkání a diferencují se na makrofágy •Receptory: •pro IgG - FcγR •pro C3b složku komplementu •komplexy MHC II třídy, nutné pro prezentaci antigenních fragmentů • •Trombocyty •u savců jsou bezjaderné, jsou to vlastně odškrcené okrsky cytoplasmy megakaryocytů •velikost asi 3 μm a často v roztěrech vytvářejí shluky •trombocyty ostatních tříd obratlovců jsou jaderné NK buňky •velké granulární lymfocyty, charakteristické povrchové znaky CD56, CD16 •schopny rychle zabíjet některé nádorové buňky a buňky infikované virem •aktivity NK komplementární k aktivitám cytotoxických T-lymfocytů Receptory: •nemají antigenně specifické receptory, •inhibiční (rozeznávají MHC I) a aktivační receptory (např. FcR - CD 16, rozeznává opsonizované částice) •aktivačně působí nízká exprese MHC I) Použité zdroje: •Atlas Hematologie zvířat: http://projekty.sosvet.cz/2006_hematologie/index.htm •Tichý F. a kol.: Histologie, VFU, 2004 •Toman a kol.: Veterinární imunologie, Grada, 2000 •Krejsek J., Kopecký O.: Klinická imunologie, Nukleus HK, 2004 •