Imunologie cvičení Fagocytóza a metody jejího sledování • • MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D. Fagocytóza •profesionální fagocyty: využívají fagocytózu k jinému účelu než je získání potravy •neutrofily, eozinofily – destrukce patogena •monocyty, dendritické buňky, makrofágy – navíc antigen prezentující funkce •fáze fagocytózy: chemotaxe, adheze, ingesce a degradace škodliviny 2 Zachycení fagocytů na endotel a průnik do tkáně Zachycení, pohlcení a destrukce patogena ve fagocytu fagocytóza Krok fagocytózy Metoda k jeho detekci 1) Chemotaxe Boydenova komůrka, Rebuckovo kožní okénko 2) Rozpoznání / navázání MSHP test 3) Pohlcení MSHP test 4) Degradace / usmrcení Detekce oxidativního vzplanutí, baktericní test MSHP test: mikrosférické hydrofilní partikule Slouží k detekci míry pohlcování (ingesce) Částice, které se v tomto testu používají jsou z z hydroxyethylmetakrylátu. 1. Plná krev se po dobu cca 60 min inkubuje s částicemi (mírného třepaní, 37 °C). 2. Ze suspenze se zhotoví krevní nátěr, který se obarví. 3. Intenzita fagocytózy se poté hodnotí vizuálně ve světelném mikroskopu. Jako pozitivní se zpravidla označují buňky, které pohltí 3 a více partikulí. Biologie a genetika pro bakaláře Zdroj: VFU Brno •V průběhu degradace se uplatňují reaktivní kyslíkové metabolity (RKM), neboli kyslíkové radikály, které vytváří fagocyt za účelem rozložení škodliviny. RKM mohou napadat molekuly lipidů, proteinů i nukleových kyselin patogena, ale hrozí i poškození vlastních tkání při nadprodukci RKM. •Reakce tvorby RKM: •1. Vznik superoxidového radikálu (NADPH oxidáza) •O2 + el O2- •2. Ze dvou molekul superoxidového radikálu vzniká peroxid vodíku •O2- . + O2- . + 2H+ H2O2 + O2 •(v kyselém pH přímo, v neutrálním vyžaduje katalýzu SOD superoxiddismutázami) •3. Peroxid vodíku přijetím elektronů (redukcí) dává vznik hydroxilovému radikálu •H2O2 + e- OH - + OH. •Buď tzv. Fentonovou reakcí – elektron poskytuje železnatý kationt, nebo Haber-Weisova reakce – elektron se získá ze superoxidového radikálu •4. Mimo to může peroxid vodíku reagovat s chloridovými anionty za vzniku kyseliny chlorné •H2O2 + 2Cl- HClO •Katalyzuje to myeloperoxidáza, je v neutrofilech . . . Všechny uvedené RKM působí jako oxidanty. Toho lze využít pro jejich detekci NBT test: Při stanovení se využívá substrát NBT – nitroblue-tetrazolium chlorid. Detekce oxidačního metabolismu je založena na přeměně bezbarvé tetrazoliové soli (NBT) na barevný formazán. NBT vstupuje do buněk a po jejich aktivaci se vlivem RKM mění na barevnou formu – tmavě modrý formazán. Změnu barvy lze měřit vizuálně v mikroskopu nebo spektrofotometricky Chemiluminiscenční analýza: je založena na reakci luminoforu (luminol nebo lucigenin) s oxidanty, zejména s peroxidem vodíku. Při reakci dochází k oxidaci luminolu na nestabilní meziprodukt, který vyzařuje energii v podobě modrého světla. Konečným produktem vzniklým z luminolu je aminoftalát. Vzniklé světlo je okem nepozorovatelné, je ho však možné registrovat na speciálním přístroji – luminometru. Míra produkce světla je přímo úměrná produkci RKM a přímo úměrná intenzitě fagocytózy. Metody detekce oxidativního vzplanutí Výstup chemiluminiscenčního měření míry fagocytózy Stanovení RKM chemiluminiscenční reakcí: více RKM = větší aktivita fagocytů Komponenty rekční směsi: Fagocyty (plná krev) Luminol Aktivátor (u spontánní reakce pufr) Pufr Měří se obvykle spontánní a aktivovaná fagocytóza Aktivátor: substance, kterou fagocyty pohlcují a tím se zahajuje fagocytární proces např. škrobová zrna, baktérie, aktivní uhlí, složky buněčných stěn baktérií nebo kvasinek) Vyhodnocení výsledku do protokolu Z dodaných hodnot CL signálu spočítat vždy průměr ze dvou paralelek pro každý měřený čas Z metodiky zjistíme jaké množství krve bylo fakticky v jamce a vypočteme, kolik z toho představují fagocyty Počet fagocytů/μl máte uvedený u výsledků, vypočítali jsme ho z absolutního počtu leukocytů a diferenciálu Pomocí trojčlenky přepočteme naměřený CL signál na 1 000 fagocytů Naměřený CL signál (průměr ze 2 jamek)………………. Počet fagocytů / μl x 2 (v jamce byly 2 μl krve) X………………………………………………………………………1 000 fagocytů Tento přepočtený signál vyneseme do grafu a určíme velikost píku a času píku pro spontánní a aktivovanou reakci Integrál křivek máme uvedený ve výsledcích, do protokolu je ho třeba také přepočítat na 1 000 fagocytů