Imunologie cvičení Imunodifúzní metody Stanovení lysozymu • MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D. Metoda imunodifúze Stará metoda, různé možnosti uspořádání a využití – tabulka. Dříve pro stanovení protilátek, hemolytické aktivity komplementu, nyní hlavně stanovení lysozymu 1 složka rozpuštěna v gelu, druhá složka se nanáší do jamek a difunduje V gelu V jamce Výsledek reakce Stanovení aktivity lyzozymu Bakterie Lyzozym Projasnění gelu Přítomnost antigenu ve vzorku Protilátka Antigen Vznik precipitačního prstence Stanovení hemolytické aktivity komplementu Senzibilizované erytrocyty Sérum s komplementem Změna barvy gelu v důsledku hemolýzy Lyzozym je látka enzymatické povahy. Rozkládá polysacharid murein, který je základní komponentou buněčných stěn bakterií, zejména G+. Výskyt: u obratlovců - sliny, krevní sérum, mléko moč, pot, cytoplazma fagocytů u bezobratlých v hemolymfě u rostlin např. Papaya latex, Ficus u bakteriofágů v základní destičce bičíku Vysoký obsah je ve vaječném bílku - z něj výroba •objeven v roce 1922 Alexandrem Flemingem •malá molekulová hmotnost (14,6 KDa) •jeden polypeptidový řetězec tvořený 129 aminokyselinami •disulfidické můstky, sekvence je známá. Lysozym rozkládá polysacharid murein tím, že štěpí b-1,4-glykosidickou vazbu, která spojuje zbytky n-acetylglukósaminu a kyseliny n-acetylmuramové. Vysoce účinný proti grampozitivním bakteriím, kterým chybí vnější membrána. Gramnegativní bakterie mohou být vystaveny působení lyzozymu teprve po poškození nebo odstranění vnější membrány (laktoferinem). Účinek na buněčnou stěnu baktérií a) Buněčná stěna grampozitivních bakterií: 1. polysacharidový řetězec peptidoglykanu (mureinu) 2. příčné propojení 3. polysacharid 4. kyselina teichoová 5. buněčná stěna 6. cytoplazmatická membrána 7. fosfolipid 8. protein b) Buněčná stěna gramnegativních bakterií: 1. lipoprotein 2. peptidoglykan 3. lipopolysacharid 4. antigeny 5. porinové trimery 6. vnější membrána 7. periplasmatický prostor 8. cytoplazmatická membrána 9. fosfolipid 10. protein 20 nm Princip metody a provedení V agarozovém gelu je rozsuspendována bakterie Micrococcus luteus – mírný zákal Do gelu se vysekají dírky (jamky) a do nich se nanáší: - kalibrační roztoky čistého lysozymu (zkum 1-5) -měřené vzorky Inkubace do doby vytvoření projasněných koleček Změření průměru (druhá mocnina) projasněných koleček Konstrukce kalibrační přímky a z její rovnice výpočet obsahu lysozymu Množství lysozymu lze vyjadřovat: jako koncentraci (mg/ml) nebo v jednotkách enzymatické aktivity U (do protokolu obojí) Speciální měřítko