Imunologie cvičení Metody stanovení komplementu • MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D. Komplement •30 komponent volných nebo membránově vázáných •9 hlavních složek C1 – C9 •Funkce: •membranolytická C5b – C9(n) •opsonizační C3b •chemotaktická – anafylatoxiny C3a,C5a, C4a • •Aktivace kaskádovitým způsobem •Z hlavních složek se odštěpují krátké úseky •Tři cesty aktivace: •Klasická (nutné protilátky) •Alternativní (reakce na umělé povrchy, bakteriální buňky) •Lektinová (interakce proteiny – sacharidy) jinak podobná klasické • • • • Metody stanovování komplementu Stanovení koncentrace jednotlivých složek v séru/plasmě •problematické, krátký poločas rozpadu, nízké koncentrace •komerční kity pro C3 a C4 složku •turbidimetricky, nefelometricky, radiální difúzí, (případně ELISA) • Stanovení membranolytické aktivity – funkční testy •měření hemolytické aktivity (lýza erytrocytů účinkem komplementu ve vzorku) •hemolýzu lze sledovat v gelu pomocí radiální difúze nebo spektrofotometricky •komerční CH 50 nebo CH 100 testy. • Biologie a genetika pro bakaláře Biologie a genetika pro bakaláře cit.vfu.cz Komplement fixační reakce (KFR) Reakce probíhá ve dvou krocích 1.Komplement se naváže na komplex antigen – protilátka (KFR lze použít pro zjišťování přítomnosti jedné z těchto složek ve vzorcích) 2. Hemolytický systém: beraní erytrocyty a králičí protilátka proti beraním erytrocytům (tzv. amboceptor neboli hemolyzin) Tento systém reaguje s komplementem a nastane hemolýza Pokud v prvním kroku nevznikne IMK, komplement se nespotřebuje a zůstane pro 2. krok reakce – hemolýza ANO Pokud v prvním kroku Ag a Ab odpovídají svou specifitou, IMK vznikne a komplement se spotřebuje – hemolýza NE --------------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------- Negativní KFR: Sérum neobsahuje protilátky proti danému antigenu a nevzniká komplex Ag-Ab, na který by mohl být vázán komplement. Po přidání hemolytického komplexu působením komplementu nastane hemolýza. Pozitivní KFR: Sérum obsahuje protilátky proti danému antigenu a komplement je tudíž vyvázán na komplex Ag-Ab. Po přidání hemolytického komplexu (beraní erytrocyty s navázaným hemolyzinem) nedochází k hemolýze Diagnostické aspekty stanovení komplementu Kdy se stanovují parametry komplementové kaskády: •podezření na deficity jednotlivých složek, kdy je snaha tyto složky přímo stanovit (C3 a C4 složky) • •imunokomplexové choroby, kdy se rovněž stanovuje C3 a C4 složka. Koncentrace uvedených složek se u těchto chorob poměrně rychle mění. Normální hodnoty C3 a C4 složky se pohybují okolo 0,2 – 1,2 resp. 0,15 – 0,4 g/l. • •celková hemolytická aktivita se vyšetřuje při opakovaných vleklých infekcích některými patogeny a dále při podezřeních na imunodeficity • •Z diagnostického hlediska má význam stanovení některých regulačních složek komplementové kaskády. Zejména jde o tzv. C1 inhibitor, který za fyziologických okolností reguluje rozběhnutí celé kaskády hned na jejím počátku. Existuje deficit této složky, který se projevuje onemocněním zvaným hereditární angioedém. Bioluminiscenční stanovení bakteriolytické aktivity komplementu Princip: •bioluminiscenční bakterie produkují světlo, to je detekováno na luminometru •po přidání komplementu (vzorek séra/plasmy) jsou bakterie lyzovány přítomným komplementem •lyzované bakterie už světlo neprodukují, tedy bioluminiscence se snižuje Míra bioluminiscence je přímo úměrná viabilitě bakterií Čím víc je ve vzorku komplementu, tím víc bakterií je lyzováno a tím menší je bioluminiscence