Imunologie cvičení
Metody separace buněk
•
•
  MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D.

Imuno-magnetická separace
Používají se tzv. selekční protilátky, které jsou pevně navázány na magnetické částice.
Používá se v pozitivním nebo negativním uspořádání
Pozitivní separace spočívá ve výběru buněk podle přítomnosti určitého znaku (povrchové molekuly)
Negativní spočívá v odstranění všech, které specifický znak nenesou.
Možnosti separace buněk
pozitivní
negativní

Gradientová centrifugace
Navrstvení nesrážlivé krve na separační gradient (např. Histopaque) s následnou centrifugací.
Celá příprava trvá asi hodinu a z 1 ml periferní krve lze získat 1 – 2 x 106 agranulocytů.
Separované buňky lze dále použít k řadě funkčních testů
(proliferační testy, testy cytotoxicity, průtoková cytometrie apod.)
Izolace lymfocytů pomocí rozet
Metoda využívá povrchových receptorů lymfocytů.
CD2 na povrchu T-lymfocytů funguje jako receptor pro povrchové antigeny ovčích erytrocytů a vytváří
s nimi tzv. rozety (označované jako T-rozety).
Podobně B-lymfocyt reaguje s myšími erytrocyty.
Phase contrast microscopy of E-rosetting of transfected COS-7 cells. Cells transfected with
constructs for rat CD2, human CD2, or mutant CD2 molecules were incubated with Neu + human
erythrocytes for 1 h at 4~ and the nonadherent erythrocytes washed off. Rosettes were examined
under light microscope. The location of the mutations in the 13 strands or loops of CD2 domain 1
are indicated in parentheses. THE CELL SURFACE MOLECULE RECOGNIZED BY THE ERYTHROCYTE RECEPTOR OF T
LYMPHOCYTES Identification and Partial Characterization Us Spontaneous sheep erythrocyte rosettes
are positive in this... | Download Scientific Diagram
Příklady roset z internetových zdrojů
https://www.researchgate.net/
Sigma-AlHistopaque®-1083
Sterile-filtered, density: 1.083 g/mL
General description
A solution containing polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.083 g/mL.
Facilitates the recovery of viable mononuclear cells from rats, mice, and other small mammals.
Histopaque®-1077 sterile-filtered, density: 1.077 g/mL | Sigma-Aldrich

Výsledek po vrstvení a centrifugaci
Figure 5
doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077112.g005

Počítá se  po obarvení Tűrkovým roztokem (1 : 20), v 50 velkých čtvercích
Počítání buněk v Bürkerově komůrce


Počítání buněk v Bürkerově komůrce
Počet před separací v plné krvi – leukocyty
Zjištěná hodnota se musí ještě přepočítat pro lymfocyty
Fázový kontrast
Po separaci – už jen agranulocyty
Bez fázového kontrastu

1. Spočítat množství leukocytů v původním vzorku krve:  počet buněk/mikrolitr krve
    a vypočítat z toho počet lymfocytů (na základě diferenciálu nebo podle fyziologických hodnot)
2. Spočítat množství  počet buněk - lymfocytů v sesbírané vrstvě: počet buněk/mikrolitr
3. Vzít v úvahu použité objemy (plné krve na počátku separace a sesbírané vrstvy po separaci)
4. Trojčlenkou určit výtěžnost reakce:
             celkový počet buněk vstupujících do reakce ………………100 %
             celkový počet buněk po separaci……………………………………X %

Úvaha pro výpočet výtěžnosti