Metody stanovení protilátek Metody •Stanovení protilátek - základní imunologická vyšetření. •stanovení kvantitativní, kvalitativní a stanovení specifických protilátek •Metody: Imunodifúze - radiální ID •Aglutinace •RIA? FIA, EIA – ELISA •Western blot •Nefelometrie, turbidimetrie •Fyziologické hodnoty množství protilátek v séru u člověka: • IgG 8 – 18 g/l; IgA 0,9 – 3,5 g/l; IgM 0,9 – 2,5 g/l; IgD 0,1 g/l; IgE 0,0003 g/l • Stanovení protilátek •SÉROLOGICKÉ METODY - všechna stanovení protilátek v krevním séru. •Příklady sérologických reakcí a způsobů vizualizace: •Aglutinace vizuálně hodnotitelný aglutinát •Precipitace vizuálně hodnotitelný precipitát nefelometrické, resp, turbidimetrické hodnocení •Komplement fixační reakce hemolýza erytrocytů •Imunoelektroforéza precipitát antigenů nebo protilátek rozdělený v elektrickém poli Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) Oblast ekvivalence Precipitační metody Oblast nadbytku protilátky Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie turbidimetrie • s markerem EIA, IRMA.. Oblast nadbytku antigenu Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA.. • homogenní EMIT… - faktory ovlivňující precipitaci: · typ Ab /např. IgG/ · teplota – se zvyšující se teplotou se urychluje precipitace /např. 38°C/ · vzájemná koncentrace Ag a Ab · pH · iontový náboj · tvar a velikost části Serologické metody – precipitace, aglutinace Důležité pojmy z oblasti sérologie jsou: • •sérokonverze – zvýšení hladiny specifických protilátek, tento pojem zahrnuje dynamiku tvorby protilátek • séropozitivita, •séronegativita – přítomnost, resp. nepřítomnost specifických protilátek v séru • sérorezistence – stav, kdy při léčbě zůstává séropozitivita bez klinických příznaků sérorecidiva – znovuobjevení pozitivity séra po přechodném vymizení specifických protilátek • •sérotyp (sérovar) skupina původců onemocnění (obvykle podmnožinu bakteriálního druhu), která se od jiných zástupců téhož bakteriálního druhu dá odlišit právě na základě sérologické reakce. Vykazuje tedy určitou antigenní specifitu v rámci druhu. Další stanovení •Stanovení IgE •Stanovení monoklonální (patologické) komponenty: při podezření na monoklonální gamapatie se stanovuje množství mono-, bi- nebo oligoklonálních protilátek, které jsou produkty jednoho nebo několika málo patologicky zmnožených klonů B lymfocytů (imunofixace). •Stanovení kryoglobulinů (např. hematologické malignity, revmatoidní artritida, vaskulitidy, chronické zánětlivé stavy, vleklé infekce apod.). Stanovení za přísných teplotních podmínek 37°C (jinak precipitace) Zákalové reakce metoda probíhající v roztoku •Princip: při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množstvím mn. Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag F4k46-o494 *NEFELOMETRIE – rozptyl monochrom. světla měřeného pod úhlem, měří se intenzita záblesků světla odraženého od IK (Tyndal. efekt), výbojka nebo laser TURBIDIMETRIE – úbytek monochrom. světla o 320nm při průchodu vzorkem v kyvetě měřeného ve stejné rovině Výhoda: možnost automatizace, rychlost provedení, přesnost, ale vyšší cena, dioda, méně přesná Imunofixace Rozdělení různých proteinů na základě jejich pohyblivosti v el. poli modifikační metodou 1.stupeň: Elfo vyšetřovaného séra 2.Stupeň: na agarózu se položí plastikované maska s výřezy, naplní se s antiséry (antiIgG, IgA, IgM, anti kappa, anti lambda), pak porovnání s precip. reakce s normálním sérem ,TSP – testovaná séra pacientů Hodnocení a)Okometricy b)denzitometricky •Využití: Stanovení c Ig, hlavních sérových proteinů, stanovení sérových bílk.(složky C, proteiny akut. fáze (CRP – stand. 2mg/l, transferin, alfa2 – makroglobulin) •Úskalí: V prec. křivce je třeba vymezit oblasti: •a)zóna využitelná pro měření Ab, tj oblast nadbytku Ab •b)Kritický bod, oblast ekvivalence, zde leží nejvyšší konc. Ag, kterou lze ještě měřit •c)oblast za krit. bodem pro Ag, zde nelze měřit •Dva režimy stanovení a)End point – měří se v prostředí polyetylénglykolu b)Rate kynetický systém – měří se kineticky , v krátkých časových intervalech Metoda ELISA Sendvičová ELISA pro protilátky Neboli nepřímá ELISA na detekci Ab – slouží na důkaz neboli titraci Ab specifických pro určitý Ag. Použití: na titraci Ab třídy IgG + IgM. 2pridasezre Antigen se naváže na tuhou fázi a promyje. Přidá se zředěné sérum, ve kterém se má určit přítomnost Ab. Inkubace, promytí – přitom dochází k navázání na imobilizované Ag Přidá se enzymem značená sekundární Ab, promytí Přidá se enzymový substrát a změří se intenzita barevné reakce.