ROSTLINNÉ EXPLANTÁTY (KULTURY IN VITRO) ÚVOD HANA CEMPÍRKOVÁ ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ FYZIOLOGIE A ANATOMIE ROSTLIN PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA, MASARYKOVA UNIVERZITA CÍLE „ pochopení základních pojmů a principů používaných v oblasti rostlinných explantátů Explantát (Bauer 1939) je každý fragment živého pletiva, celý orgán nebo soubor orgánů, který je vytržen z korelačních vztahů celku a je pěstován v umělých podmínkách. Definice termínů Úrovně organizace explantátu Dospělá rostlina Dospělá rostlina Embryo, klíční rostlina Orgán Pletivo Buňka Buňka: mikrospory, pylová zrna, buněčné suspenze Izolovaný protoplast Příklady různých typů kultur kalusová kultura kultura prýtů prašníková kultura tabáku suspenze buněk vojtěšky rostlinné protoplasty mezofylu tabáku ex plantare = pěstovat mimo in vitro = ve skle, v umělých podmínkách aseptická kultura = bez infekce (bakterie, kvasinky, plísně) axenická kultura = kultura jednoho organismu tkáňová kultura = historický pojem, přeneseno z oblasti fyziologie živočichů Definice termínů Infekce v kulturách Obsah obrázku rostlina, interiér, zelenina, zavřít Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku jídlo, talíř, polévka, snězeno Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku interiér, kiwi Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku hrníček, interiér Popis byl vytvořen automaticky Příklady infikovaných kultur kultura infikovaná kvasinkami a bakteriemi kultury infikované houbami Kultivační nádoby pro kultury in vitro (sklo i plasty) média ztužená zkumavky, Petriho misky, Erlenmayerovy baňky, zavařovací lahve, sklenice od dětské výživy, Magenta boxy… Výsledek obrázku pro petri dish plants Obsah obrázku text, interiér, přeplněné, jídelní stůl Popis byl vytvořen automaticky Kultivační nádoby pro kultury in vitro (plasty) Suspenzní kultury média tekutá (nutné zajištění provzdušňování) laboratorní bioreaktor laboratorní třepačka Bioreactor Types For Plant Cell Suspension Culture Cell cultivation in the bioreactor - what should be considered | INFORS HT Shaking Cells to Produce Novel Products | Labcompare.com Systém Rita® dočasně zaplavované kultury technická modifikace pro pěstování explantátů v tekutém médiu www.vitropic.fr ROSTLINNÉ EXPLANTÁTY > Plant Tissue Culture & Plant Biotechnology | FarmERP „ zpočátku obor rostlinné fyziologie odlišující se svou vlastní metodologií „ „ v současnosti jsou metodickou základnou rostlinných biotechnologií „ „ později četné aplikace v genetice a šlechtitelství „ „ mají využití i v molekulární biologii –jsou součástí metod množení rostlin, transformace, selekce … A.Získání teoretických poznatků -buněčné dělení -totipotence rostlinné buňky -diferenciace rostlinné buňky a pletiva -metabolismus -regulační mechanismy -transformace a mutageneze Využití explantátů B. Praktické aplikace -rychlé množení ve velkých kvantech -urychlování šlechtitelských cyklů -získávání vzdálených hybridů („embryo rescue“, opylení in vitro) -získávání haploidů a dihaploidů -ozdravování od virů -umělá semena -genové banky, kryoprezervace Příklady výzkumných laboratoří v ČR: •Univerzita Karlova (Praha): https://sites.google.com/a/natur.cuni.cz/lab007/ •Univerzita Palackého (Olomouc): http://www.rustreg.upol.cz/o-nas/ •ČZU, Fakulta tropického zemědělství (Praha): https://www.ftz.czu.cz/en/r-9419-departments/r-10236-laboratories/r-10239-laboratory-of-plant-tissu e-cultures •https://ucb.af.mendelu.cz/veda-a-vyzkum/vyzkumna-skupina-nanobiotech-rostlin-a-mikroras/laborator- rostlin/ •Laboratoř tkáňových kultur rostlin na MENDELU: Agronomická fakulta (Brno), Zahradnická fakulta (Lednice), Botanická zahrada a arboretum (Brno: https://web2.mendelu.cz/arboretum/) •Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod - https://www.vubhb.cz/cs/laborator-tkanovych-kultur Historický přehled počátků rostlinných tkáňových kultur Gottlieb Haberlandt * 1854 Altenburg (Mosonmagyaróvár) † 1945 Berlín považovaný za otce kultur rostlinných explantátů Kultivoval explantáty: - parenchym listů - dřeň stonku - svěrací buňky průduchů - trichomy Tradescantia ale i sběratel prvních zklamání -neznalost výživy (Knoppův roztok, sacharóza, asparagin a pepton) a fytohormonů - nesterilní kultura - vysoce diferencované buňky v kultuře krátkodobé přežívání kultur přesto Haberlandt věřil v budoucnost kultur in vitro a formuloval 1902 teorii o totipotenci rostlinné buňky (“one could successfully cultivate artificial embryos from vegetative cells.”) (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen) “my knowledge, no systematically organized attempts to culture isolated vegetative cells from higher plants have been made. Yet the results of such culture experiments should give some interesting insight to the properties and potentialities which the cell as an elementary organism possesses. Moreover, it would provide information about the inter-relationships and complementary influences to which cells within a multicellular whole organism are exposed” (from the English translation by Krikorian & Berquam, 1969) 1922 Knudson - výsevy orchidejí in vitro 1925 Laibach – izolovaná embrya lnu (Linum) „Totipotence“ rostlinné buňky totipotence diferencovaných rostlinných buněk předpovězena v roce 1902 Gottliebem Haberlandtem (1854 –1945) a v roce 1958 experimentálně potvrzena Reinertem a Stewardem somatickou embryogenezí u mrkve dnes se doporučuje termín totipotence nepoužívat nahradit jeho význam termínem pluripotence Totipotence = schopnost jedné buňky dát vznik všem typům buněk Pluripotence = schopnost dělení kmenové buňky a její schopnost diferenciace První pravé „tkáňové kultury“ americký rostlinný fyziolog Philip Robert White (1901 –1968) 1935 P.R.White – kultura izolovaných kořenů rajčat - cukry - vitamíny -B1, B6, kyselina nikotinová - glycin - meristém kořenové špičky produkce fytohormonů Kalusové kultury 1939 R. J. Gautheret - kalus vrby 1938 P. Nobécourt - kalus tabáku 1938 White – kalus tabáku (N. glauca x N. langsdorfii) Meristémové kultury 1944 - Ernest Ball - regenerace rostliny z izolovaného meristému (Lupinus) 1949 – Limmaset a Cornuet - rozdílné koncentrace virových částic v rostlinných orgánech, meristémy téměř viruprosté 1952 – Morrel a Martin - ozdravování virózních jiřin (Dahlia) meriklonové množení Different stages of in vitro callus induction and plant regeneration... | Download Scientific Diagram PDF] In vitro plant production through apical meristem culture of Gentiana kurroo Royle | Semantic Scholar 1958 – Steward a Reinert - tekuté médium, třepané kultury buněk a buněčných shluků Somatická embryogeneze pokusné potvrzení platnosti buněčné teorie Schleidena (1838) a Schwanna (1839) i Haberladtovy teorie o totipotenci somatických buněk Suspenzní kultury kalusy i regenerace rostlin Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures | Nature Protocols How Does a Single Somatic Cell Become a Whole Plant? 1960 - indická škola: Kanta, Maheshwari, Rangaswami různé metody aplikace pylu na explantát 1965 - polská škola: Zenkteler – společná kultivace pylových zrn a vajíček – vznik mezidruhových a mezirodových hybridů 1965 - české pokusy: Tupý, Balatková (ČSAV Praha), Sladký (MU Brno) Opylení a oplození in vitro A calcium influx is triggered and propagates in the zygote as a wavefront during in vitro fertilization of flowering plants | PNAS Haploidní techniky 1942 – LeRue – první pokus o kulturu vajíček 1949 - LaRue – první kontinuálně rostoucí pletivo z endospermu nezralých semen kukuřice 1965 – úspěšná regenerace rostlinek organogenezí Schematic of a flower - Lizzie Harper 1970 - Takebe a Nagata - regenerace rostlinek tabáku z izolovaných protoplastů - fůze protoplastů - somatická hybridizace = cybridy Rostlinné protoplasty 1974 - důkaz integrace Ti plasmidu do rostlinného genomu 1984 - přímý přenos DNA do rostlinného protoplastu (mikroinjekce) 1986 - přímý přenos DNA do rostlinných buněk Geneticky modifikované organismy = GMO Transformace rostlinného genomu Marc van Montagu s Jeffem Schellem Ti …. Tumor indukující (Agrobacillus tumefaciens) Vývoj živných médií -V počátcích živné roztoky (např. Knopův), které obsahovaly méně než 200 mg/l solí (minerálních) -Heller (1953) zdvojnásobil množství na základě zkušeností - Nitsch a Nitsch (1956) zvýšili až na ca 4 g/l - nebylo to pořád optimální: proto přídavky kvasničného extraktu, bílkovinných hydrolysátů, kokosové vody -Murashige a Skoog (1962) – mj. analýza popela z kalusu tabáku: médium s koncentrací některých solí 25x větším než Knopův roztok, vysoká koncentrace NO3- a NH4+ a více druhů mikroprvků - tzv. MS médium (makro- a mikroživiny, zdroj uhlíku, redukovaný dusík, B vitamíny, příp. růstové regulátory) „Biotrend“ BIOTRIN je česká nezisková organizace vytvořená vědeckými pracovníky pro šíření informací o moderních biotechnologiích http://www.biotrin.cz/ informace nejen o českých biotechnologiích http://www.gate2biotech.cz/ Doporučená literatura –skripta KOVÁČ, J.(1992): Explantátové kultury rostlin. -Ústí n. Labem (Skriptum UJEP). VOTRUBA, M. et al.(1987): Explantátové techniky (pro biotechnology a šlechtitele).-Praha (Skriptum VŠZ Praha). ŠEBÁNEK, J. et SLADKÝ, Z.(1988): Biotechnologie rostlinných explantátů.-Brno (Skriptum VŠZ). (nyní MZLU) Užitečné stránky (angl.): https://www.plantcelltechnology.com/blog/ „Plant tissue culture“