06_ Kalusové kultury Indukce a jejich využití Rostlinné explantáty Mgr. Hana Cempírková, Ph.D. Kalus • Co je kalus a jak ho vytvořit? • Jaká jsou stádia vývoje kalusu? • Jaké je využití kalusu? • Co jsou suspenzní kultury, jak se vytváří a jaké je jejich využití? Základní pojmy •Diferenciace •Dediferenciace •Rediferenciace • • •Totipotence •Pluripotence Frontiers | Callus, Dedifferentiation, Totipotency, Somatic Embryogenesis: What These Terms Mean in the Era of Molecular Plant Biology? Dediferncovaný stav – buňky získávají zpět schopnost se diferencovat (developmental potency). Dediferenciace buněk v přírodě Jak vzniká kalus in vitro a z jakých částí rostlin může pocházet? -Střední poměr auxinů k cytokininům kalus -Vysoký poměr cytokininů k auxinům prýt -Vysoký poměr auxinu k cytokininům kořeny - Fáze růstu kalusu: 1.Lag fáze (buňky se připravují na dělení) 2.Exponenciální fáze (buňky se dělí nejrychleji) 3.Lineární fáze (dělení buněk se zpomaluje, buňky se zvětšují) 4.„Zpomalovací“ fáze (zpomaluje se dělení buněk i jejich zvětšování) 5.Stacionární fáze (počet i velikost buněk zůstává konstantní) Využití kalusových kultur • informace o schopnostech regenerace rostlin • izolace protoplastů • iniciace suspenzních kultur • genetické manipulace • časově neomezený růst v in vitro podmínkách („nesmrtelná kultura“) Opakovaným pasážováním se stává kalus více homogenním – výhoda pro dlouhodobé pěstování v in vitro Výsledek obrázku pro callus plants http://plantcellbiology.masters.grkraj.org/html/Plant_Growth_And_Development10-Physiology_Of_Flower ing.htm Zajímavé stránky carrot cloning http://projects.ncsu.edu/project/bio183de/Lab/development2_lab/development2_3.html Vyzkoušíme ve cvičení – iniciace kalusu ze segmentů kořene mrkve („klasická“ úloha) Suspenzní kultury • rychle rostoucí buňky • homogenní nebo buněčné agregáty • rozmíchání v tekutém médium • možnost odvození buněčné linie („cell line“) Iniciace suspenzní kultury buněk •fragmenty nediferencovaného kalusu 2 - 3 g / 100 mL • ↓ • tekuté medium • ↓ • ↓ • ↓ • pasáže • ↓ • ↓ • ↓ • kultura suspenze buněk • aerace míchání (agitace) výběr malých shluků buněk Sigmoidální růst (S): Lag fáze -- logaritmická (log, exponenciální) -- Stationary phase Growth curve copy Lag Log Stationary Exponential Linear Progressive deceleration Charakter růstu suspenzní kultury buněk 1. interval subkultivace pasáž ve stacionární fázi dlouhý růstový cyklus dlouhá lag fáze Faktory ovlivňující růst 1. interval subkultivace pasáž v log fázi --> krátký krátký Kdy do nového média? (pasážování) ATCC - Cell Growth and Propagation Faktory ovlivňující růst: 2. Hustota buněk při iniciaci vysoká hustota buněk nízká počáteční hustota buněk --> krátká lag fáze málo buněčných dělení dlouhá lag fáze dlouhý exponenciální růst kritická iniciální hustota --> Faktory ovlivňující růst: 2. Iniciální hustota buněk obecně 0.5 – 2.5 x 105 buněk / ml 4 – 6 dělení 1 – 4 x 106 buněk / ml 1. Úvod do cvičení. Biologická data Bezpenost prce v mikrobiologick laboratoi Ochrana pl rukavice Využití rostlinných suspenzních kultur • tvorba klonů jedné buňky (klonování) • studium morfologických a biochemických změn během růstových a vývojových fázi • studium buněčného metabolismu • kultury jednotlivých buněk umožňují rychlý a zjednodušený výběr buněk s různými vlastnostmi • produkce kultur s vysokým výtěžkem i s výhodnými agronomickými znaky • tvorba sekundárních metabolitů • ve studiu mutageneze lze mutagen přidat rovnou do tekutého média https://www.urbanpro.com/class-xi-xii-tuition-puc/cell-suspension-culture-plant-tissue-culture • Cell potential, animal cloning Can any cell develop into a complete organism? How do you clone a sheep? - ppt download ptc-001 Schéma Bergmannovy techniky výsevu buněk (Konar 1960) Buněčné stěny rostlinných buněk jsou adhezivní a přirozeně jsou k sobě přitohovány, proto suspenze opravdu samostatných buněk je zatím nemožná (vždy budou apoň maličké shluky). Kalus - shrnutí • CIM (callus inducing medium) •Auxiny a cytokininy ve středním poměru • auxin 2,4-D Overview of Callus and Organ Culture! - Plant Cell Technology | Your partner in plant tissue culture DEDIFERENCIACE vs. DIFERENCIACE •Indukce – růst - organogeneze Frontiers | Callus, Dedifferentiation, Totipotency, Somatic Embryogenesis: What These Terms Mean in the Era of Molecular Plant Biology? Tvorba kalusu není zpětný krok ve vývoji, ale spíše výsledek nadměrného dělení/transdiferenciace diferenciovaných buněk. Některé nebo většina buněk heterogenního kalusu může mít zvýšenou vývojovou potenci (developmental potency – schopnost se vyvíjet)