Bi6721c Speciální metody analýzy mikroorganizmů Purifikace proteinů 1 Cvičení 5 – předpříprava Otázky odpovídejte stručně, orientujte se podle velikosti pole pro odpověď, které by mělo být dostatečné. Jako podklady mohou sloužit materiály z přednášek, významnější podíl však bude mít využívání volně dostupných internetových či knižních zdrojů. Napište 4–5 příkladů využití purifikovaných proteinů: Vyjmenujte základní využívané metody purifikace proteinů a jejich stručnou charakterizaci – k jaké interakci dochází, podle čeho se proteiny dělí (velikost, náboj, afinita, konformace apod.), typické využití metody (velký objem vzorku, nižší výsledná čistota vs. malý objem vzorku a velmi vysoká výsledná čistota purifikovaného proteinu): Co předchází purifikaci proteinů? Napište 2–3 věty; pro inspiraci můžete použít některé z pojmů níže (nesnažte se využít všechny!). Kultivace Heterologní exprese Indukční činidlo Lyze buněk Plasmid Transformace Barvení buněk Klonování PCR Elektroforéza Selekční marker CentrifugaceSekvenování Funkční assay Specifická enzymatická aktivita Typizace bakteriálního kmene Bi6721c Speciální metody analýzy mikroorganizmů Purifikace proteinů 2 Návrh metody Doplňte text popisující purifikaci proteinu zájmu. Informace čerpejte z přiloženého schématu plasmidu, z přednášek SMAM a z internetu. Expresní kmen E. coli BL21(DE3) obsahující plasmid pET21b(+)_gene of interest kultivujeme v ______ médiu s ___________ při ____ °C do ___________ ____________ fáze růstu kultury. Poté zaindukujeme produkci proteinu zájmu přidáním ______ (typický rozsah koncentrací používaných pro indukci: ________ až __________). Tato látka je strukturní analog cukru _________ a uvolňuje represor ______ z jeho cílové sekvence (operátoru), čímž spouští produkci ______________. Tento protein poté umožňuje expresi proteinu zájmu z ____ promotoru. Buňky po indukci kultivujeme při 20 °C po dobu 20 h. Na konci kultivace buňky sklidíme centrifugací a promytím pufrem odstraníme zbytky růstového média. Buňky poté rozbijeme, abychom z nich uvolnili nitrobuněčně produkovaný protein. Buňky lze rozbít fyzikálně (například metodou _______________), chemicky, nebo pomocí enzymu ____________. Buněčný lyzát opět zcentrifugujeme a získáme tak bezbuněčný extrakt (cell-free extract), který použijeme jako vstupní materiál pro purifikaci proteinu zájmu. Díky tomu, že __________________________________________________________________________ (napište vlastnost proteinu zájmu), můžeme pro purifikaci použít metodu __________________ _________________. Během této metody se __________ __________ (část proteinu) váže na ionty ______, _________, ___________, nebo ___________ navázané na matrici v purifikační koloně. Protein zájmu se po nanesení na kolonu s matricí naváže na výše zmíněné ionty, ostatní buněčné proteiny zůstanou nenavázané (nebo budou s matricí interagovat nespecificky, a tedy daleko silněji / slaběji (zakroužkujte správné) než protein zájmu). Pro odmytí nenavázaných proteinů z kolony použijeme nejprve roztok s 5 / 25 / 500 mM koncentrací látky _________, která je strukturně podobná __________. Nespecificky navázané proteiny odmyjeme z kolony pomocí 5 / 25 / 500 mM roztoku. Protein zájmu nakonec uvolníme (eluujeme) z kolony 5 / 25 / 500 mM roztokem _________ (název látky). Čistotu purifikovaného proteinu poté zjistíme pomocí metody ______________.