Cvičení 5 – předpříprava

Otázky odpovídejte stručně, orientujte se podle velikosti pole pro odpověď, které by mělo být
dostatečné. Jako podklady mohou sloužit materiály z přednášek, významnější podíl však bude mít
využívání volně dostupných internetových či knižních zdrojů.


Napište 4–5 příkladů využití purifikovaných proteinů:

Vyjmenujte základní využívané metody purifikace proteinů a jejich stručnou charakterizaci – k jaké
interakci dochází, podle čeho se proteiny dělí (velikost, náboj, afinita, konformace apod.),
typické využití metody (velký objem vzorku, nižší výsledná čistota vs. malý objem vzorku a velmi
vysoká výsledná čistota purifikovaného proteinu):

Textové pole: Indukční činidlo Textové pole: Selekční marker Textové pole: Lyze buněk Textové pole:
Transformace Textové pole: Heterologní exprese Textové pole: PCR Textové pole: Barvení buněk
Textové pole: Plasmid Textové pole: Typizace bakteriálního kmene Co předchází purifikaci proteinů?
Napište 2–3 věty; pro inspiraci můžete použít některé z pojmů níže (nesnažte se využít všechny!).

Textové pole: Funkční assay Textové pole: Kultivace Textové pole: Elektroforéza Textové pole:
Specifická enzymatická aktivita Textové pole: Centrifugace Textové pole: Klonování Textové pole:
Sekvenování

Návrh metody

Doplňte text popisující purifikaci proteinu zájmu. Informace čerpejte z přiloženého schématu
plasmidu, z přednášek SMAM a z internetu.


Expresní kmen E. coli BL21(DE3) obsahující plasmid pET21b(+)_gene of interest kultivujeme v ______
médiu s ___________ při ____ °C do ___________ ____________ fáze růstu kultury. Poté zaindukujeme
produkci proteinu zájmu přidáním ______ (typický rozsah koncentrací používaných pro indukci:
________ až __________). Tato látka je strukturní analog cukru _________ a uvolňuje represor ______
z jeho cílové sekvence (operátoru), čímž spouští produkci ______________. Tento protein poté
umožňuje expresi proteinu zájmu z ____ promotoru.

Buňky po indukci kultivujeme při 20 °C po dobu 20 h. Na konci kultivace buňky sklidíme centrifugací
a promytím pufrem odstraníme zbytky růstového média.  Buňky poté rozbijeme, abychom z nich uvolnili
nitrobuněčně produkovaný protein. Buňky lze rozbít fyzikálně (například metodou _______________),
chemicky, nebo pomocí enzymu ____________. Buněčný lyzát opět zcentrifugujeme a získáme tak
bezbuněčný extrakt (cell-free extract), který použijeme jako vstupní materiál pro purifikaci
proteinu zájmu.

Díky tomu, že __________________________________________________________________________ (napište
vlastnost proteinu zájmu), můžeme pro purifikaci použít metodu __________________
_________________. Během této metody se __________ __________ (část proteinu) váže na ionty ______,
_________, ___________, nebo ___________ navázané na matrici v purifikační koloně. Protein zájmu se
po nanesení na kolonu s matricí naváže na výše zmíněné ionty, ostatní buněčné proteiny zůstanou
nenavázané (nebo budou s matricí interagovat nespecificky, a tedy daleko silněji / slaběji
(zakroužkujte správné) než protein zájmu). Pro odmytí nenavázaných proteinů z kolony použijeme
nejprve roztok s 5 / 25 / 500 mM koncentrací látky _________, která je strukturně podobná
__________. Nespecificky navázané proteiny odmyjeme z kolony pomocí 5 / 25 / 500 mM roztoku.
Protein zájmu nakonec uvolníme (eluujeme) z kolony 5 / 25 / 500 mM roztokem _________ (název
látky). Čistotu purifikovaného proteinu poté zjistíme pomocí metody ______________.