Cvičení č. 6
Purifikace rekombinantního proteinu
afinitní chromatografií
Přírodovědecká fakulta MUNI
Brno, duben 2024
CO NÁS DNES
ČEKÁ…
1) Teoretický úvod k tématu
2) Seznámení se s protokolem ke cvičení
3) Separace buněk z média centrifugací
4) Lyze buněk a separace CFE centrifugací
5) Purifikace GFP-His a BglC-His metaloafinitní
chromatografií
pET EXPRESNÍ SYSTÉM
BL21(DE3)
PŘÍPRAVA BUNĚČNÉHO
EXTRAKTU
Podstatou je lyze buňky a odstranění buněčných obalů
▪ Buněčné stěny u G+/G- bakterií či kvasinek, proteinové
kapsidy u virů
ODSTRANĚNÍ OBALŮ CHEMICKY
▪ Chemická činidla narušují integritu buněčných stěn
▪ Důležité je chemické složení buněčné stěny
▪ Druhé činidlo pak naruší buněčnou membránu (lipidy)
▪ Klasický postup u E. coli a příbuzných bakterií:
lyzozym + EDTA + SDS
…a jak to funguje?
MECHANISMUS ÚČINKU LYSOZYMU
▪ EC 3.2.1.17, muramidáza, patří mezi glykanhydrolázy
▪ Hydrolýza vazeb 1,4-β mezi N-acetylmuramovou
kyselinou a N-acetyl-D-glukosaminem v peptidoglykanu
MECHANISMUS ÚČINKU EDTA
Etylendiamin tetraacetát (EDTA)
▪ Chelatační činidlo, vychytává Mg2+
, které pomáhají
udržovat integritu buněčných obalů
▪ Inhybuje nukleázy s kofaktorem Mg2+
, které by mohly
degradovat NK
MECHANISMUS ÚČINKU SDS
Dodecylsulfát sodný (SDS)
▪ Aniontový detergent
▪ Rozrušuje vrstvu fosfolipidů ve vnitřní či vnější
membráně
▪ Narušuje nekovalentní vazby proteinů a denaturuje je
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Založena na vysoce specifických interakcích biomolekul
▪ Enzym-substrát, protilátka-antigen, receptor-ligand,
protein-NK, rekombinantní protein-protilátka atd.
▪ Stacionární fázi tvoří jedna z interagujících molekul
vázaná na pevný nosič
▪ Vazebný partner je vychytáván ze směsi v mobilní fázi
▪ Eluce pufry o ↑ či ↓ pH či iontové síle (změna konformace
či náboje) nebo s ↑ konc. ligandu (kompetice)
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
http://ruo.mbl.co.jp
▪ Komerčně dostupné předplněné kolony s matricí
▪ Nejčastějšími nosiči jsou polysacharidové gely
(agaróza),
celulóza, polyakrylamid
▪ Různé vstupní materiály: bakteriální či kvasinkový lyzát,
růstové médiu, krevní sérum…
▪ Nejčastější využití pro purifikaci NK či proteinů
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
▪ Založena na silné vazbě mezi histidinem a iontem Ni
v zásaditém pH
▪ 6xHis tag na N nebo C konci rekombinantního proteinu
▪ Ni-NTA (nitriltrioctová k.) agaróza jako stacionární fáze
Ni-NTA METALOAFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
histidin
imidazol
FPLC (FAST PROTEIN LIQUID CHROMATOGRAPHY)
www.knauer.net
FPLC CHROMATOGRAM
High imidazol wash
Imidazol
0.5
POLYAKRYLAMIDOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PAGE)
Nativní PAGE a SDS (sodium dodecil sulfate) PAGE
▪ Proteiny rozděleny na polyakryalmidovém gelu na
základě jejich elektroforetické mobility
▪ Ta je fukcí délky AA řetězce (Mw), konformace (tvaru) a
náboje molekuly
▪ U SDS-PAGE na tvaru molekuly nezálěží, protože je
denaturována
teplem a detergentem dodecylsulfátem
sodným, který zárověň AA řetězci dodá negativní náboj
POLYAKRYLAMIDOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PAGE)
Příprava gelu:
▪ 30% akrylamid (toxický!!!) + 0.8% bis-akrylamid
▪ Pufr (většinou mírně zásaditý Tris), stabilizuje - náboj
▪ dH2
O, (+ SDS v případě denaturující PAGE)
▪ Peroxodisíran amonný (APS)
▪ Tetramethylethylenediamine (TEMED)
▪ Barvení: bromfenolová modř, Coomassie Brilliant Blue
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4
NATIVNÍ VS. DENATURUJÍCÍ PAGE
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
NATIVNÍ VS. DENATURUJÍCÍ PAGE
Shi et al. (2013) Systematic functional comparative analysis of four single-stranded
DNA-binding proteins and their affection on viral RNA metabolism. PLoS ONE, 8(1):e55076
4x 2x
?x
?x
SDS-PAGE PO PURIFIKACI: VÝSLEDEK
kDa
80
49
35
29
kDa
124
80
49
35
29
I0 I FT W E I0 I FT W E
GFP-CtDoc-His
(36,5 kDa)
BglC-CtDoc-His
(63,5 kDa)