ToxCast s>EPA A To)?/ ★ ** * * * EU * * ★ M ToxBank Moderní metody v toxikologii a jejich aplikace d8.3.24» J. Procházková Zrození AOP konceptu a odpovídající metodologie Původní schéma testování toxicit Expozice cíl - zajistit bezpečnost léčiv a životního prostředí Tkáňová koncentrace Biologicky efektivní dávka Raná odpověď Patologie Krewski, 2010 Zrození AOP konceptu a odpovídající metodologie Aspekty toxikologie pokryté Tox21 strategií Toxicita látek a stanovení mechanismu účinku vč. rizik environmentálni polutanty In silico aditiva kontaminanty potravin průmyslové chemikálie léčiva • AOP koncept • bio/monitoring • prevence pesticidy In silico toxikologie / machine learning Raies, 2016 Steps for generating prediction models Data gathering L, Molecular descriptors Model evaluation Methods for generating the models Read-across PK and PD predikce a modelování na základě struktury látky srovnávání s databázemi látek, kde je znám vztah struktura-toxicita Komputační toxikologie - modelování drah Law, 2023 Datasets ToxCast Assays Proti Prot 2 Prot 3 Prot 4 BPA 0 1 0 1 T3 N/A 1 1 0 Lovastatin 0 0 0 N/A ... Signaling-Weighted Human Interactome Lov.j-rnT3Li Toxicant Signaling Network Construction Inputs Outputs EdgeLinker BPA Lov O O Responsive receptors <0> & transcription factors Compute k highest scoring paths BPA Chemical Signaling Network Evaluation Functional Enrichment, Case Studies Overlap with CTD Statistical Significance A Compute null distribution of km path scores, compare to real k"- path score modelování signálních složek kombinace ToxCast a CTD (databáze interakcí „látka-gen") dat s databází lidského interaktomu Aspekty toxikologie pokryté Tox21 strategií Toxicita látek a stanovení mechanismu účinku vč. rizik environmentálni polutanty In silico aditiva kontaminanty potravin průmyslové chemikálie léčiva • AOP koncept • bio/monitoring • prevence pesticidy In vivo vs In vitro komplexní tkáňové prostředí organismu úroveň metabolismu odpovídá reálné situaci efektivní určení poměru dávka vs. efekt testování směsí na orgánové a organizmální úrovni • možnosti qHTS provedení • odhalení nových látek • snaha nahradit in vivo testy in vitro testováním • snazší reproducibilita speciální požadavky a zázemí pro chov dedikovaný personál časová a finanční náročnost otázka etiky • cena • přístrojové zázemí • chybí orgánový a komplexní kontext In vivo toxikologie př. zebrafish výhody Zebrafish modelu - monitoring přítomnosti toxických látek - odhalení mechanismu účinku - testování vlivu urč. genu či signální dráhy na toxicitu vyvolanou testovanou látkou - tkáňové prostředí r* V I V Hemato- H 1 logy L. J L J Response element Reporter gene 4 Contaminants RFPGFP zebrafish zygote No contaminants Dai, 2013 Cassar, 2020 In vivo toxikologie př. zebrafish Arsenic B PA TCDÜ a Embryo Larvae/] uvemle Cardiovascular defects apoptosis >H yperactivity Adult Fl Reduced ^ biomass at 3 months Gene expression, rnetaboiomtc changes, fatty 11 ver Increased ^rate of heart failure Skeletal and cardiovascular defects Decreased ONA methyJation fn gonad, blocked ovulation, reproductive defects £ Skeletal defects, ÄÄ^.Poor embryo reproductive defects quality i Bambino, 2017 re In vivo toxikologie př. zebrafish př. testovaných parametrů - FET - fish embryo acute toxicity test Table 1. Apical observations of acule toxicity in zebrafish embryos 24 - 96 hrs post fertilisation. Exposure 1 imes 24 hrs 48 hrs 72 hrs 96 hrs Coagulated embryos + 4- + + . Lack of somite formation + + Ť . N on-detachment of lire tail + -- . Lack of heartbeat + + + a b t ft 3. t-'ig. 2; Lack uf sumitt! lorrtialiun: Although retarded in development by appro*. 30 lira, the 24 hrs old zebrafish embryo in (a) shows w.d [-developed somites (—whereas the embryo in (b) does nut ahitw any sign of BUiniie formation (—►). '• I i • . showing .■ pronounced yolk sac oedema the 48 hrs old iebraliih embryo in (et show? distinct formation of SOrnileS {—•), whereas the $6 his old ^ebrafish embryu depicted in |d) dues nut show any sign of somice formation <—•). Note also the spina] curvature (scoliosis) and [lie pericardial uedcrna (*) in [he embryo shown in (d}_ Test No. 236 - OECD In vivo toxikologie př. zebrafish př. testovaných parametrů hepatotoxicita acenaftenu Survival rate 24h LC50=23.15mg/L 48h LC50=18.32 mg/L 72h LC50=12.60 mg/L WJ aktivita jaterních enzymů A Al.T £ 100 0.5 10 15 Log (Acenaphthene mg/L) *** 60000 é* jfr Jľ Jľ J- jŕ jŕ .<ŕ ,o w Protein or peptide MS Proteome j~ extraction ..................'. - SS-«*/ Cell ortissue Proteoforms ln-gel separation (SDS-PAGE) BOTTOM-UP Digestion 2D LC Peptide MS Data analysis PROTEOFORM IDENTIFICATIONS f Protein ID ■( Quantitation \PTM Mapping Data analysis CANONICAL PROTEIN IDENTIFICATIONS (including amino acid variants) Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika př. HPLC-MS/MS 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy Impact the metabotype Mathematical modeling and pathway analysis Diagnostic biomarkers Mechanistic insights Metabolomika • informuje o vlivu expozice na biochemické úrovni a poskytuje biomarkery spojené s aktuálním stavem expozice jedince, jeho zdravotním stavem atp. • buněčné a tkáňové zdroje -moč, sliny, sérum... • koncept „exposome" = „kumulativní analýza environmentálních vlivů, stravy, chování atp. na biologické procesy v průběhu života jedince" Early detection for early intervention Disease diagnosis and treatment monitoring Identification of exposure reduction prioritization Target identification for drug or nutritional interventions Molecular and Biochemical Toxicology, 5th edition Ukázka propojení „omic" metod Environment International 157 (2021) 106802 ELSEVIER Contents lists available at SciemceDirect Environment International journal homepage: www.elsevier.com/locate/envint Integrated multi-omics analysis reveals the underlying molecular mechanism for developmental neurotoxicity of perfluorooctanesulfonic acid in zebransh Cirok rgr ugdalca Hyqjin Lee1, Eun Ji Sung1 \ Seungwoo Seo , Eun KÍ Min Ji-Young Leed, Ilseob Shim1', PUje Kim", Tae-Young Kinť,1,2) Sangkyu Lee11'3'^ Ki-Tae Kima* " Department ofEnvironmental Engineerings Seoul National University of Science and Technolog/, Seoul 01B11, Republic of Korea h BK21 FOUR Communiiy-Eased Intelligent Nave). Drug Discovery Education Unit, College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Kyungpoak National University. Daegu 41566, Republic of Korea r School of Earth Sciences and Environmental Engineering, Gvuangju Institute of Science and Technology. Gwangju 610O5, Repubhc of Korea d Environmental Health Research Department, National Institute of Environmental Research, Inchean 22689, Republic of Korea • PFOS - transkriptom, proteom, metabolom - indukce vývojové neurotoxicity - deregulace oxidativního stresu a energetického metabolismu - indukce zánětu, deregulace Ca2+ signalizace, deformace axonů Lee, 2021 Ukázka propojení „omic" metod VIER Contents lists available at ScienceDirect Science of the Total Environment journal homepage: www.elsevier.com/locate/scitotenv Metabolomics and proteomics study reveals the effects of benzo[a]pyrene on the viability and migration of KYSE-150 esophageal cells c^tS' Yuting Shen, Guangshan Xie, Siyi Lin, Lin Zhu, Hongna Zhang, Zhu Yang * Zongwei Cai Stale Key Laboratory af Environmental and Biologkal Analysis, Department of Chemistry, Hang Kong Baptise Univcrsiry, Hong Kong, China • kombinací metod lze získat informaci o změně profilu genové transkripce indukované testovanou látkou a zároveň identifikovat biomarkery expozice v příslušné tkáni Ukázka propojení „omic" metod Shen, 2022 Cell culture Metabolites extraction LC-MS/MS I m/z Protein extraction Digestion & labeling LC-MS/MS Data analysis Fig. 1, Schematic workflow of the integrated metabolomics and proteomics study approach applied in the present study. - B [a] P caused reduced cell viability and increased oxidative stress in esophageal cells. * Ln response to B[a]P treatment of cells, TXN was u pre filiated and GSH depleted. * B[a]P induced the expression of bath tumor suppressor and promoter proteins, such as Si00 family, AXN, Basigin and Serpin B5. * B[a]P not only inhibits cell proliferation but also impairs the cell mobility of the esophageal epithelial cells. GSH conjugates ETHE1 H20 Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii i_i 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy qHTS assays - štandartní testy cytotoxicity a proliferace - aktivita NADPH oxidáz (př. MTTtest) - spotřeba ATP (př. Cell TiterGlo) - poškození membrány (př. LDH assay) - produkce aminů (př. Live/Dead fixable dead cell stain) - množství DNA(př. CyQuant) Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii i_i 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy qHTS assays - specifické testy - kvantitativní monitoring buněčné morfologie pomocí impedance - reportéry enzymatické aktivity - reportéry transkripční aktivity (př. Attagene Transfactorial, CALUX) - disrupce mezibuněčné komunikace (př. GJIC, TEER) - detekce disrupce syntézy a metabolismu hormonů Monitorování buněčné impedance •••• XAACEA Biosciences, Inc. í> stanovení vlivu testované látky na základní buněčné parametry vč. cytotoxicity (no cell} electrode ŤŤŤŤŤŤŤtŤŤŤŤ electrode without cell • cell electrode electrode attached with 1 cell cells electrode electrode attached with 2 cells baseline impedance ®® ® z = z, L cell 1 impedance increased %%> ® z-z, L cell 2 impedance doubly increased o Analýza růstu, proliferace, adheze Solly, 2004 Monitorování buněčné impedance Research A Section 508-conformant HTML version of this articie is available at https://doi.orgyiO.1289/EHP7102, Aggressiveness and Metastatic Potential of Breast Cancer Cells Co-Cultured with Preadipocytes and Exposed to an Environmental Pollutant Dioxin: An in Vitro and in Vivo Zebrafish Study Meriem Kmtai+!-2:,f Celine Tomkiewicz,1* Ida Chiara Guerrero,4 David Sherry Robert BaroukitiJ and Xavier CoumoulL3f 'UMR-51124. Institut national de la samé et de la recherche médicale (Inserm), T3S. Toxicologie Environnementale, Cibles thérapeutiques. Signalisation cellu taire et Biomarqueurs. Parii. France "Service cJe Chirurgie Caneeruiogique Gynceologique et du Sein, Hůpital Européen Georges-Pompidou. Assistance Publique~l-iopitaux Je Paris. France ^Universitě de Paris. Paris. France 4Plateforme proteomique 3P5-Necken Structure Federative de Recherche Necker. Universitě de Paris, US24/CNRS UMS3633, Inserni, Paris, France ^Department of Environmental Health. Boston University School of Public Health, Boston. Massachusetts, USA příklad in vitro vs. in vivo přínosu Monitorování buněčné impedance B □AY 1- IYICF7 cells or MDA-MB231 are cultivated in 6-well plata, co-exposed or not to hMADS cells during 24 hours. insert -0.4 i in i pores . hMADS cells culture medium OAY 2- Exposition to TCDD 25 nM MCF7 cells or MDA-MB31 DAY 4 SUPERNATENT Store at -80 °C MCF7 or MDA-MB231 Response analysis it H lil O L Control - L TCDD ~_ TCDD treatment ......i.......-t*^ * ji^*#H^MW ^ ř Co cu|!ure _ ......1........Í«shmi F Coesppsure i,........If^C p 'C^,,, €.......................... '!■■'-■»■ j-........................i......................JíÉjíP^^t^,i^^TTTTT^rrr. 1 | Í.........i....... Ml 10.0 Tims (in Hourl 150 žádný efekt dioxinu na buněčnou impedanci Figure I. Co-culture model and real lime MCF7 cells analysis. (A) Presentation of the 2D co-culture system and the protocol. {B) xCELLigence dynamic monitoring of MCF-7 cells, A representative graph from xCELLigence system: cell index (CI) profiles are the mean + SD (duplicate) of each condition: Control (*, vehicle MCF-7 cells, alone), TCDD ($, MCF-7 cells treated with 25 nM TCDD), co-culture (€, MCF-7 co-cultured with hMADS) and coexposure (&, co-Luliure with TCDD). (C) The evoluiiori of the CI for each condition was determined by analyzing the slope of the line in the interval (26-48 fi). Each graph represents the mean slope (in bold) compared with the control ± SEM for six measurements. The numerical information mean ± SEM and p-values are provided in Table SI. (Kruskal-Wallis's H test (nonparametric comparison oft independent series) followed by a 1-factor ANOVA test (parametric comparison of A independent series), **p < 0.01; *p < 0.05). Nose: ANOVA. analysis of variance; SEM. standard error of the mean; TCDD. 2.3,7.8-tetradilorGdibenzo-p-dioxin. Koual, 2021 Monitorování buněčné impedance vs. in vivo test šíření metastáz MCF7 ,r -f- m T 30i Si 11 C .5 ! Figure fi. Measurement of metastatic spread orMCF7 and MDA-MB231 cells iji zebralisli larvae in vivo models Human RFP-MCF7 (left) or RFP-MDA-MB-231 (right) cells cultured with conditioned media from different conditions, were injected into the penvitelline space of 2-day-old zebralish larvae [Control (vehicle MCF-7 cells, alone), TCDD (MCF-7 cells treated with 25 nM TCDD), co-culture (MCF-7 co-cultured with tiMADS), and coexposure (co-culmre with TCDD)]. Fish were imaged 24 h later at 8,5 x magnification by fluorescence microscopy. (A) Representative images from 21^16 fish/group, (B) Quantitation of (a) the number of fish with one or more metastases and (b) the average number of metastases/fish+SE, Graph represents means ±SEM of three measurements. The numerical information mean±SEM and /^-values are provided in Table 58, (Kruskal-Wallis's H test (nonparametric comparison of k independent series) followed by a 1-factor ANOVA test (parametric comparison of k independent series. * p<0.D5). (C) The percentage of fish with metastasis in the head region. Each experiment was repeated in triplicate (MCF-7) or quadruplicate (MDA-MB-231) with 7-12 fish per condition in each experiment. Note: ANOVA, analysis of variance; SEM, standard error of the mean; TCDD, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-/j-dioxin. efekt dioxinu na formaci metastáz Koual, 2021 Mikroelektrodové arrays AXION BIOSYSTEMS Imagine • Explore ■ Discover 0 síť elektrod monitorující elektrický odpor vytvářený buňkami c> měří elektrickou aktivitu buněk ® AXION Mean Firing Rate = n of Spikes / Time Burst of Action Potentials ^^^^ \_ \mJ» 1! III ! II 17 1 41 _ ■ ■ _ Activity , , Oscillotion ' Connectivity 6 o 4 Synchrony Axion Biosystems Příklad testování neurotoxicity AXION BIOSYSTEMS Imagine • Explore ■ Discover MEA preparation 384 ToxCast compounds (222 active in single-concentration screen) were screened in a concentration range (7 concentrations, 0.03-40uM) Compounds were analyzed in 43 parameters (including MFR) 1. Primary cortical neurons are cultured in 43-well MEA plates for 13 days «■BSSSBS j D i 3. Determine parameter activity En each well for 40 min prior to and after treatment with compounds 2 Plates are plsced m ;he a j ion Maestro MEA amplifier 1. Characterize chemical potency and assess multiple parameters 2. Develop a method to distinguish between neuroactive and non-neuroactive compounds 3. Determine what could be driving different neuroactivity patterns Axion Biosystems TEER analýza * „Transepithelial electrical resistance" o měření permeability buněčných membrán skrze měření elektrického odporu » test disrupce mezibuněčných spojení o monitoring permeability buněčných bariér o informace o kompaktnosti buněčné vrstvy a mezibuněčných těsných spojů o př. tkáňová toxicita - Gl, plíce, BBB ... TEER measurement with chopslick electrodes. The total electrical resistance includes the uhmic resistance of the cell layer Rtt^r, the cell culture medium RM, the semipermeable membrane insert R[ and the electrode medium interface Rpjmi- Srinivasan, 2015 re TEER assay - příklad Shaughnessey, 2022 HKHHHHHHKHHH HHKHHHHHKHHH HHHHHHHHKMHM - HKHHHHHHKHHH "HHKHHHHHKHHH HKHHHHHHKHHH HKHHHHHHKHHH HHKHHHHHKHHH o O Kvantifikace obrazové informace TJs 5uM 15 |jM 25|jM Untreated Vehicle Flow #1 Top Channel Membrane pnmarni vaskulární endotelie o i o I o i o I o [ o I o ledvinové proximální T epiteliální z buňky Untreated Vehicle | Co-culture, low FSS Mono-culture, low FSS Co-culture, high FSS Mono-culture, high FSS 5 |JM Dose 15 uM 25 uM * nefrotoxicita cisplatiny - 96-well formát - 2 formáty mikrofluidity TEER assay - příklad Shaughnessey, 2022 HKHHHHHHKHHH HHKHHHHHKHHH HHHHHHHHKMHM - HKHHHHHHKHHH "HHKHHHHHKHHH HKHHHHHHKHHH HKHHHHHHKHHH HHKHHHHHKHHH ---JSU- . _ Flow #1 Top Channel Membrane Flow #2 Bottom Channel J 7. TEER - Kvantifikace prostupnosti bariéry epitel-endotel csPt t = 24 hr t = 48 hr t = 72 hr Untreated Vehicle 5 |jM 15 25 \M Untreated Vehicle %\M 15 \M 25 |jM Untreated Vehicle 5 |jM 15 25 (j M * nefrotoxicita cisplatiny - 96-well formát - 2 formáty mikrofluidity Stanovení transkripční aktivity jaderných receptoru (NR) 0 Attagene FACTORIAL™ assay *• odhalení módu agonista, antagonista o cis; a trans- mód Attagene Cis Assay (Example: PPREl .Chemical x 1 £ HpaJ FPRľ f I Attune Trans Assay {Example; PPARy) Vjxiahk Di state* |1 Hpl ITARt ATTAGENE Reporter Assays Transcription of Kcpancr ■ lipul mil Mulit eDNA. add adapter l.itbcl Adaplti and cm with Upal L.hinnliljLCť l.alicl k.-f^iU-i ,-\ 4£ RCfrOJlťl U Rqpwwr (' KepoitnD Capillars Electrophonet$ c> Multiple repoter transcription unit (MRTU) + chimeric Gal4-NR protein c> až 48 typů lidských jaderných receptoru Testování transaktivace NRs - CALUX 0 DR, AR, PR o detekce reportéru tj. aktivita luciferázy Recombinant cell Furans I I AhR complex ARNT DRE CYP1A1 From contaminated sites př. DR-CALUX Nucleus 11 n ore Luclfarase Cytoplasm rnRNA I nc reased cytoc h rome P4501 A-1 Luc ite rase activity an cl oth e r p i ote i ns [y1 1 Sakthivel, 2016 re Testování transaktivace - DR CALUX® o př. skríning PCBs a dioxinových látek v rybách o může DR CALUX „nahradit" štandartní GC/MS? O stabilní linie-H4IIE, HepG2 Mol. Nutr. Food Res. 2006, 50, 345 - 357 DDI 10.1002ymnír.200GOOOG1 The use of the DR CALUX® bioassay and indicator polychlorinated biphenyls for screening of elevated levels of dioxins and dioxin-like polychlorinated biphenyls in eel Ron Hoogenboom1, Toine Bovee1, Win Traag1, Ronald Hoogerbrugge2, Bert Baumann2, Liza Portier1, Guido van de Weg1 and Jaap de Vries3 1 RIKILI, Institute of lood Safely, Wagetiiiigeri, The Netherlands ; RIVM. Bilthoven, The Netherlands 1 VWA, Zulpheii, The Netherlands 70 y = 0.028X + 9.360 [¥ = 0.91 m) 1000 1500 2000 indicator PCBs (ng/geel) * GC/MS- limitace- malé množství vstupního vzorku, cena, náročnost analýzy TEQs- toxic equivalence Hoogenboom, 2006 concentration + TEFs TEFs - toxicity equivalency factors Testování znečištění ovzduší © Cite This: Environ. Sei. Techno!. 2018, 52, 2926-2933 pubs.acs.org/est Development and Application of a Novel Bioassay System for Dioxin Determination and Aryl Hydrocarbon Receptor Activation Evaluation in Ambient-Air Samples Songyan Zhang,*'" Shuaizhang Li/'" Zhiguang Zhou/'" Hualing Fu/'* Li Xu/Heidi Qunhui Xie,*'*'* and Bin Zhao*'t4® + _ State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China + "University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China *State Environmental Protection Key Laboratory of Dioxin Pollution Control, National Research Center for Environmental Analysis and Measurement, Beijing 100029, China Zhang, 2018 Testování znečištění ovzduší CBG2.8D MDL: 0.1 pM P Ambient-Air 1 LT Q ! PCDDs ! PCDFs I *Q*>" L j DL-PCBs I * ! Others i_______ : k* +Luciferi n Lucrtarasft Dioxin Determinations Total AhR Activation (TAA) ►"ODO* * sensitivní metoda pro detekci aktivace AhR a stanovení rizik pro látky vyskytující se v ovzduší (Polycyklické aromatické uhlovodíky -PAHs) Zhang, 2018 0.6 i £ 0.4 J Ě S 12 " Of " □ PAHs I DL-PCBs n-.n-, B í; o _ = e o o — m (B an 40 ~ S 20 * y = 110.50X + 33.98 R>=0.90 02 S3 Relative Toxicity Equivalents of the PAHs (pg TED m-3) n M 4 TO O — m Ě 3 os 2 s 00 ■— rj O 1 CÚ ü y = 5.81x + 0.12 R2 = 0.97 V • o o 0.2 0.4 0.6 HRGC-HRMS (pg l-TEQ m3) 0 3 Analýza vazby ligand-receptor e> NovaScreen NR HTS Ligand-Binding Assay 0 cell-free formát 0 kompetitivní assay - př. radioaktivní estradiol vs. testovaná látka, vazba na ERalpha í> AR, ER, PXR, FXR, PPARa, PPARg, TRa Wash buffer Filter :H NH.- Unbound ligand Testování enzymatické aktivity - DI01 Iodine Inflammation Selenium Cytokines Iron EOC ■_ Drugs V / 4 atomy I ve struktuře TH production 80% Tt 20% T," DICH. DI02 Activation 'LI TH Inflammation Selenium Cytokines Carbohydrate diet EOC Drugs 1 r ^t>- D101.DI0Z ""V Activation 0101 DI03 TH Inactivation (fT3.3,3T2...) / \ DI01 & DJ03 : DI03 EOC Hypoxia Drugs High Inflammation proliferation EOC Drugs 3 atomy I ve struktuře + volný atom I Growth Metabolism 0; consumption Body temperature rain development * Inhibice aktivity chemickými látkami -cell-free assay * Inkubace enzymu s testovanými látkami 3h o Pokud dochází k inhibici aktivity klesá nárůst volného jódu, který se následně stanovuje o 96-well formát, HEK293 DI01-OE Köhrle, 2022 Analýza disrupce syntézy steroidních hormonů o CeeTox H295R steroidogenesis assays 0> stanovení vlivu testované látky na syntézu steroidních hormonů c> odhalení endokrinních disruptorů o 96-well format o Detekce 13 steroidních hormonů pomocí LC-MS/MS CeeTox H295R steroidogenesis assays MTC Evaluation Plate Cells {overnight) A 10 piM FSK (48 hrs) > A H295R cells seeded to confluency Concentration-Response ^SSBBimwA pre-treatment: stimulate steroidogenesis Chemical (48 hrs) 100 uM chemical treatment io jim FSK (48 hrs) A Chemical (48 hrs) H295R cells seeded to ~50% confluency pre-treatment: stimulate steroidogenesis 6 cone, chemical treatment MTT Cytotox > Media to Op Ans Cell viability >70% else: lOx dilution HPLC-MS/MS quantification of 13 hormones MTT Cytotox Ceil viability %1 Media to OpAns HPLC-MS/MS quantification of 13 hormones Osnova Konzorcia, databáze, projekty 1. ToxCast 2. Tox21 3. CTD - Comparative Toxicogenomics Database 4. ExpoCast - modely predikující expozici 5. Human Toxome project - „multiomic" nástroje 6. ToxRefDB 7. ToxBank 8. TOXRIC 9. ToxNET 10. ... Zajímavý literární zdroj TOXICITY FORECASTER (TOXCAST) IN VITRO ASSAYS Assay Documentation for Non-Guideline In Vitro Test Methods February 22, 2022 ToxCast í> Toxicity Forecaster + In vitro qHTS výstupy ("high-throughput screening") předpovídající toxicitu testovaných látek 0 EPA - -700 HTS, 300 signálních drah o využívá vysokokapacitní metody a výpočetní počítačové modely pro vytvoření předpovědi toxické aktivity určité látky a stanovení rizika í> >2000 chemických sloučenin - různé zdroje # farmaceutický, chemický, kosmetický průmysl, environmentálni zdroje, bezpečnost potravin ToxCast HTS Assays: >1100 readouts / effects r Assay Provide ACE A Apredica Attagene BioSeek CellzDirect NCGC/Tox21 NHEERL MESC NHEERL NeuroTox NHEERL Zebrafish NovaScreen Odyssey Thera Biological Response cell proliferation and death cell differentiation mitochondrial depolarization protein stabilization oxidative phosphorylation reporter gene activation gene expression (qNPA) receptor activity receptor binding /^Target Family^ Response Element Transporter Cytokines Kinases Nuclear Receptor CYP450 / AD ME Cholinesterase Phosphatases Proteases XME metabolism GPCRs Ion Channels r Assay Design viability reporter morphology reporter conformation reporter enzyme reporter membrane potential reporter binding reporter inducible reporter ^ Readout Type Single Multiplexed Multiparametric Cell Format Cell free Cell lines Primary cells Complex cultures ^Free-living embryosJ Species Human Rat Mouse Zebrafish Sheep Boar Rabbit Cattle V Guinea pig J Tissue Source Lung Breast Liver Vascular Skin Kidney Cervix Testis Uterus Brain Intestinal Spleen Bladder Ovary Pancreas Prostate Inflammatory Bone V Detection Technology qNPAand ELISA Fluorescence & Luminescence AlamarBlue Reduction Arrasyscan / Microscopy Reporter gene activation Spectrophotometry Radioactivity HPLCand HPEC TR-FRET R. Judson, EPA, 2012 re Tox21 Attene-Ramos, 2013 > In vitro toxikologie 21. století (est. 2008) C> robotizace, 1536-well formát C> -80 assays o Cíle: Thomas, 2018 Public database Data sharing íffk í^aluxol b»jťob^|y frugmm /VCGC Assay optimization Validation Robotic ... .... ... .. Miniaturization validation Ú P B 3 Data processing Drug Discovery Today 1 identifikovat mechanismus biologické aktivity testovaných látek určit látky pro další extenzivní testování vývoj modelů pro predikci in vivo odpovědi vývoj strategických a operačních plánů National Center for Advancing Transiational Sciences T0X21 GATEWAY LQG IN Tox21 Program Applications - Resources ■* Contact Us Toxicology in the 21 st Centu Through a Memorandum of Understanding, research, develop, validate and translate innovative g testing methods that characterize toxicity pathways Research, develop, validate and trans I chemical testinq methods that characterize toxicity pathways: ^ chemical testing methods that characterize toxicity pathways. zakladatelské organizace: Environmental Protection Agency (EPA), National Toxicology Program (NTP), National Institute of Environmental Health Sciences, National Center for Advancing Transiational Sciences (NCATS) and Food and Drug Administration (FDA) g iox2l Public Data OS Tox2l Assay Tracking U í ox2l Data Browser Ö 1ox2l Data Download .Ii Pathway Browser Q Collaborator Download S í'ox21 Manuscripts A Tox21 Assays S (ox21 Publications □ I ox21 Presentations \e*_ f'ox21 Curve Browser /'SAR Tools ■ft í0x21 Data Processing / Assay Annotation Update iw Curve Fitting Q Structure Search Toxikologie 21. století Děkuji za pozornost ©