Základy klinické onkologie Martin Bartošík, MOÚ Úvod do nádorové biologie 6.3.2024 Pozor, na konci soutěž ☺ Dávejte pozor Proč se tvoří nádory? Proč se v některých rodinách šíří opakovaně? Proč u někoho vznikne nádor brzo a někdo ho vůbec nedostane? Je rakovina častější dnes než v minulosti? Rakovina: genetické onemocnění • Akumulace somatických mutací v protoonkogenech a nádorových supresorových genech vedoucí ke vzniku nádoru • Důkazy • Nádorový stav je klonálně dědičný (dceřiné buňky jsou rakovinné) • Viry způsobují indukci nádorů • Hereditární nádory v rodině • Mutagenní látky způsobují nádory Rakovina: genetické onemocnění • Akumulace somatických mutací v protoonkogenech a nádorových supresorových genech vedoucí ke vzniku nádoru • Epigenetické změny • Důkazy • Nádorový stav je klonálně dědičný (dceřiné buňky jsou rakovinné) • Viry způsobují indukci nádorů • Hereditární nádory v rodině • Mutagenní látky způsobují nádory • Onkoviry – viry způsobující karcinogenezi • DNA viry i RNA viry (retroviry) DNA mutace – dědičná změna v sekvenci DNA • Vedou k variabilitě genomů, podmínkou evoluce • Malá (ale přece) chybovost v DNA opravné mašinerii • Somatické (v nepohlavních buňkách, všechny klony buňky mají mutaci) • Hereditární mutace (pohlavní b., mutace se přenáší na potomstvo) • Spontánní – bez externí příčiny, chyba během replikace DNA • Indukované – vnější faktory, mutageny DNA mutace – dědičná změna v sekvenci DNA Missense (záměna jednoho nukleotidu vede ke změně AK a nefunkčnímu nebo trvale aktivnímu proteinu) GTG → GAG (gen BRAF, mutace V600E) → melanom DNA mutace – dědičná změna v sekvenci DNA Missense (záměna jednoho nukleotidu vede ke změně AK a nefunkčnímu nebo trvale aktivnímu proteinu) GTG → GAG (gen BRAF, mutace V600E) → melanom Nonsense (záměna jednoho nukleotidu vede ke stop kodonu a zkrácenému proteinu) → BRCA1 u nádorů prsu DNA mutace – dědičná změna v sekvenci DNA Missense (záměna jednoho nukleotidu vede ke změně AK a nefunkčnímu nebo trvale aktivnímu proteinu) GTG → GAG (gen BRAF, mutace V600E) → melanom Nonsense (záměna jednoho nukleotidu vede ke stop kodonu a zkrácenému proteinu) → BRCA1 u nádorů prsu Indels (inzerce a delece jednoho nebo více nukleotidů v genu) → posun čtecího rámce → inaktivace proteinu APC → polypy a kolorektální karcinom DNA mutace – dědičná změna v sekvenci DNA Missense (záměna jednoho nukleotidu vede ke změně AK a nefunkčnímu nebo trvale aktivnímu proteinu) GTG → GAG (gen BRAF, mutace V600E) → melanom Nonsense (záměna jednoho nukleotidu vede ke stop kodonu a zkrácenému proteinu) → BRCA1 u nádorů prsu Indels (inzerce a delece jednoho nebo více nukleotidů v genu) → posun čtecího rámce → inaktivace proteinu APC → polypy a kolorektální karcinom Chromosomové přestavby (spojení dvou chromosomů) → vznik fúzního genu a nesprávně fungujícího proteinu → fuzní gen BCR::ABL (Filadelfský chromosom) u chronické myeloidní leukemie (Proto)onkogeny • Poprvé popsány jako virové onkogeny (v-onc) • Virus vstříkne do buňky RNA nebo DNA → přepis do mRNA → tvorba virových proteinů • Virový onkogen kóduje proteinkinázu → fosforylace a aktivace proteinů důležitých při proliferaci buněk • Buněčné (savčí) homology v-onc jsou protoonkogeny (c-onc), pokud mutuje, tvorba nádorů (Proto)onkogeny • Poprvé pospány jako virové onkogeny (v-onc) • Virus vstříkne do buňky RNA nebo DNA → přepis do mRNA → tvorba virových proteinů • Virový onkogen kóduje proteinkinázu → fosforylace a aktivace proteinů důležitých při proliferaci buněk • Buněčné (savčí) homology v-onc jsou protoonkogeny (c-onc), pokud mutuje, tvorba nádorů • Peyton Rous (1909) – přenos viru z nemocné na zdravou slepici • Rous sarcoma virus (RSV) Nádorové supresorové geny • Kódují proteiny regulující genovou expresi a buněčný cyklus • Obě alely genu musí být inaktivovány mutací (Knudsonova hypotéza dvou zásahů) Epigenetické změny • epigenom embrya může být změněn vlivem environmentálních faktorů (dieta, alkohol,…) během těhotenství • známé případy - nedostatek kys. listové (vitamin B12) v dietě matky vede k defektům neurální trubice • sklon k obezitě u dětí narozených během nebo těsně po hladomoru v Nizozemsku během 2. sv. války • projevení obezity u jednoho ze dvou jednovaječných dvojčat (epigenetická regulace několika genů proteinem Trim28) • dědičné změny ve struktuře a funkci genů bez změny v sekvenci DNA • metylace DNA, acetylace histonů, působení nekódujících RNA • Metylován je zejména cytosin (v pozici C5) v dinukleotidu CpG (CpG = Cytosin-fosfát-Guanin) • Nerovnoměrná distribuce, vyšší hustota v CpG ostrovech • Cca. 2-7% cytosinů v genomu je metylováno • Metylace je obnovena v dceřiných buňkách pomocí metyltransferáz DNA metylace • Metylován je zejména cytosin (v pozici C5) v dinukleotidu CpG (CpG = Cytosin-fosfát-Guanin) • Nerovnoměrná distribuce, vyšší hustota v CpG ostrovech • Cca. 2-7% cytosinů v genomu je metylováno • Metylace je obnovena v dceřiných buňkách pomocí metyltransferáz Funkce metylace - tlumení exprese genů tím, že brání vazbě TF DNA metylace Hypermetylace promotorů tumor supresorových genů může vést ke karcinogenezi • Metylován je zejména cytosin (v pozici C5) v dinukleotidu CpG (CpG = Cytosin-fosfát-Guanin) • Nerovnoměrná distribuce, vyšší hustota v CpG ostrovech • Cca. 2-7% cytosinů v genomu je metylováno • Metylace je obnovena v dceřiných buňkách pomocí metyltransferáz Funkce metylace - tlumení exprese genů tím, že brání vazbě TF DNA metylace • RNA nepřekládaná během translace do proteinů (vše kromě mRNA) • Součástí „junk“ DNA (98,5% lidského genomu) • nejpočetnější skupinou je mikroRNA (>38,000 sekvení v miRBase), jednořetězcové • siRNA je dvouřetězcová a exogenní Nekódující RNA funkce mikroRNA role v karcinogenezi mikroRNA mikroRNA Základy klinické onkologie Základní znaky nádorů • 6 znaků nádorové buňky (hallmarks of cancer) Hanahan a Weinberg (Cell 2000, 100, 57-70) Základy klinické onkologie Udržení proliferační signalizace • Proliferace – buněčné dělení pomocí mitózy • Normální buňky potřebují externí mitogenní růstové signály (mitogeny) • EGF (epidermal growth factor), vazba na EGFR nebo HER2 • TGFα (transforming growth factor), vazba na EGFR • PDGF (platelet-derived growth factor), vazba na PDGFR • Podporují přechod z G1 do S fáze buněčného dělení Buněčný cyklus • G0 – klidová fáze • G1 – fáze "růstu buňky" (8-30 hodin) Zvýšení transkripce proteinů, které regulují dělení Vyžaduje mitogenní růstové faktory; ztráta těchto faktorů zastaví dělení • Restrikční bod – není cesty zpět, dělení proběhne, nyní nezávislé na růstových faktorech • S fáze – fáze syntézy DNA, duplikace chromosomu • G2 – druhá mezifáze (3-5 hodin) • M fáze – mitóza Buněčný cyklus Regulace cyklu: • cyklin-dependentní kinázy (CDK) a cykliny • CDK musí být spojeny s cyklinem, aby byly aktivovány • fosforylace a inaktivace pRb → pokračování v dělení za bod restrikce Základy klinické onkologie Udržení proliferační signalizace • Nádorové buňky – nezávislost na mitogenech • Alternativní dráhy: • Produkce vlastních růstových ligandů • Zvýšená exprese receptorů (hypersenzitivita k malému množství ligandů; HER2 overexprese u nádorů prsu, léčba trastuzumabem) • Trvalá aktivace proteinů signální dráhy za receptorem (downstream), např. mutace V600E trvale aktivuje onkoprotein BRAF (50% melanomů), prediktor léčby Základy klinické onkologie Udržení proliferační signalizace • Nádorové buňky – nezávislost na mitogenech • Alternativní dráhy: • Produkce vlastních růstových ligandů • Zvýšená exprese receptorů (hypersenzitivita k malému množství ligandů; HER2 overexprese u nádorů prsu, léčba trastuzumabem) • Trvalá aktivace proteinů signální dráhy za receptorem (downstream), např. mutace V600E trvale aktivuje onkoprotein BRAF (50% melanomů), prediktor léčby Základy klinické onkologie Udržení proliferační signalizace • RAS proteiny – malé GTPazy, součástí buněčné signalizace, zapínají buněčné dělení • U lidí: HRAS, KRAS a NRAS • Vazbou na GTP je aktivován, hydrolýzou GTP je deaktivován • V nádorech je mutován a trvale aktivní • KRAS: Mutace v kodonech 12 a 13 (wt je GGTGGC) • KRAS mutace je negativní prediktor anti-EGFR terapie KRAS Základy klinické onkologie Únik růstovým supresorům • Normální buňky přijímají antiproliferativní (inhibiční) signály - zástava buněčného cyklu • Retinoblastomový protein (pRb) je tumor supresor - zpracovává signály a rozhoduje o zastavení dělení (gatekeeper) Základy klinické onkologie Únik růstovým supresorům • Normální buňky přijímají antiproliferativní (inhibiční) signály - zástava buněčného cyklu • Retinoblastomový protein (pRb) je tumor supresor - zpracovává signály a rozhoduje o zastavení dělení (gatekeeper) • pRb defosforylován v G1 fáze → vazba na E2F transkripční faktory → inhibice dělení Základy klinické onkologie Únik růstovým supresorům • Normální buňky přijímají antiproliferativní (inhibiční) signály - zástava buněčného cyklu • Retinoblastomový protein (pRb) je tumor supresor - zpracovává signály a rozhoduje o zastavení dělení (gatekeeper) • pRb defosforylován v G1 fáze → vazba na E2F transkripční faktory → inhibice dělení • Na konci G1 hyperfosforylace pomocí CDK/cyklin → uvolnění E2F → progrese do S fáze a dělení Základy klinické onkologie Únik růstovým supresorům Nefunkční pRb vede ke karcinogenezi • Inaktivační mutace v obou alelách (viz Knudsonovu hypotézu) vede ke ztrátě funkce (loss of function) Základy klinické onkologie Únik růstovým supresorům Nefunkční pRb vede ke karcinogenezi • Inaktivační mutace v obou alelách (viz Knudsonovu hypotézu) vede ke ztrátě funkce (loss of function) • Onkovirové proteiny se vážou na pRb a inaktivují ho (E7 protein u HPV, následný vznik cervikálního karcinomu) Základy klinické onkologie Únik programované buněčné smrti • Programovaná buněčná smrt - apoptóza – přesně řízený proces degradace buňky (z řečt. „opadat“) • ‚Klidný‘ proces, nevyvolává zánět, 30-120 min, kaspázy, integrita membrány zachována, fagocytóza (24 hod) Základy klinické onkologie Únik programované buněčné smrti • Programovaná buněčná smrt - apoptóza – přesně řízený proces degradace buňky (z řečt. „opadat“) • ‚Klidný‘ proces, nevyvolává zánět, 30-120 min, kaspázy, integrita membrány zachována, fagocytóza (24 hod) • Apoptóza je vyvolána např.: • Když buňka pevné tkáně ztratí kontakt se svým okolím • V buňkách napadených virem • Po poškození DNA • Při embryonálním vývoji orgánů • Při absenci růstových faktorů • Když buňka obdrží signál ligandu Fas nebo TNF-α • Při uvolnění cytochromu C z mitochondrií Základy klinické onkologie Únik programované buněčné smrti • Rakovinné buňky deaktivují apoptotickou mašinerii • Ztráta funkce proteinu p53 • Zvýšená exprese antiapoptotických faktorů (Bcl-2) • Snížená exprese proapoptotických faktorů (Bax, Bak, Puma) Základy klinické onkologie Únik programované buněčné smrti • p53 protein – „Guardian of the genome“ • Mutace v p53 až u 50% nádorů Základy klinické onkologie Únik programované buněčné smrti Hotspot mutace v p53 (obvykle missense) Základy klinické onkologie Nekonečný replikační potenciál • Normální buňky se dělí 60-70x (Hayflickův limit) • Pak nastává senescence (zastavení dělení, buňka může dál žít) • Na koncích DNA jsou telomery –repetitivní sekvence které se při každém dělení zkracují (u lidí TTAGGG, 500-3000 repeticí) • 3 funkce • Brání degradaci DNA konců DNázami • Zabraňují fúzi chromosomových konců • Usnadňují replikaci DNA Základy klinické onkologie Nekonečný replikační potenciál • Normální buňky se dělí 60-70x (Hayflickův limit) • Pak nastává senescence (zastavení dělení, buňka může dál žít) • Na koncích DNA jsou telomery –repetitivní sekvence které se při každém dělení zkracují (u lidí TTAGGG, 500-3000 repeticí) • 3 funkce • Brání degradaci DNA konců DNázami • Zabraňují fúzi chromosomových konců • Usnadňují replikaci DNA Nádorové buňky doplňují telomery pomocí enzymu hTERT (telomeraza) → přídává hexanukleotidy na konec DNA → imortalizované buňky („nesmrtelné“) Základy klinické onkologie Vyvolání angiogeneze • Angiogeneze – tvorba nových kapilár • Aktivní během embryogeneze • Výrazně omezena v pozdějších fázích života • Aktivátor angiogeneze – VEGF (vascular endothelial growth factor) a FGF (fibroblast growth factor) • Endogenní inhibitory: angiostatin a endostatin • V normální tkáni jsou v rovnováze, v nádorech je rovnováha vychýlena k aktivátorům Základy klinické onkologie Invaze pomocí metastáz • Metastázy – druhotné nádorové ložiska – příčina až 90% úmrtí na rakovinu Základy klinické onkologie Invaze pomocí metastáz • Metastázy – druhotné nádorové ložiska – příčina až 90% úmrtí na rakovinu • Šíření metastáz přes krevní řečiště nebo lymfatický systém • Nejčastější místa metastatických nádorů: plíce, játra, mozek a kosti • Hypotéza: epiteliálně-mesenchymální tranzice (EMT) + opačný proces MET Základy klinické onkologie Invaze pomocí metastáz • Hlavní krok u EMT – ztráta exprese E-cadherinu (drží buňky pohromadě), nárůst N-cadherinu a vimentinu • Transkripční represory inhibující tvorbu E-cadherinu a podporující EMT: Snail, Slug, Twist, ZEB aj. Nové znaky Umožňující faktory Deregulace metabolismu Únik imunitní odpovědi Genomová nestabilita a mutace Nádorový zánět • Rok 2011 Základní znaky nádorů - update Základy klinické onkologie Deregulace metabolismu • Glykolýza – přeměna glukózy na pyruvát • V aerobních podmínkách pak nastává oxidativní fosforylace v mitochondriích • ~ 18x efektivnější než anaerobní glykolýza při nedostatku kyslíku (svalová horečka) Základy klinické onkologie Deregulace metabolismu • 1925 – Otto Warburg • Nádorové buňky i v aerobních podmínkách metabolizují glukózu glykolyticky • Výrazně rychlejší než v mitochondriích • Jev pojmenoval aerobní glykolýza • Nobelova cena 1931 Základy klinické onkologie Deregulace metabolismu Základy klinické onkologie Deregulace metabolismu • Proč jsou nádorové buňky tak neefektivní? • Rychlá potřeba ATP, častá hypoxie • Obrovská spotřeba glukózy • Nadměrná exprese glukózových transportérů GLUT1 → zvýšený import glukózy do buněk Deregulace metabolismu PET scan Poločas rozpadu ~ 110 min Základy klinické onkologie Únik imunitní odpovědi • Imunitní systém hraje důležitou roli při kontrole rakovinných buněk (imunodeficientní jedinci mají vyšší výskyt nádorů než imunokompetentní) • Imunoeditace nádorů – teorie popisující vztah mezi imunitními a nádorovými buňkami • Zahrnuje 3 fáze – eliminace, rovnováha, únik Základy klinické onkologie • Imunitní dohled • Vrozený a adaptivní IS vyhledává a eliminuje nádorové buňky (způsobující zánět) • Nachází pouze vysoce imunogenní buňky • Slabě imunogenní přežijí Eliminace Základy klinické onkologie • Růst nádoru pozastaven • Málo imunogenní klony přežívají ve stavu dormance • Může trvat roky Eliminace Rovnováha Základy klinické onkologie Eliminace Rovnováha Únik • Přežívající nádorové buňky dál mutují • Získají schopnost skrýt se imunitnímu systému • Ztráta exprese MCH I. třídy (inhibice prezentace antigenů) • Exprese molekul vypínající T buňky • Vytvoření nádorového mikroprostředí • Nádor roste Základy klinické onkologie Nádorové mikroprostředí • Buňky, molekuly a krevní cévy, které obklopují a vyživují nádorovou buňku, tvoří mikroprostředí nádoru • Parenchym: nádorové buňky, nádorové kmenové buňky • Stroma: fibroblasty, imunitní buňky, endoteliální cévní buňky, ECM, MMP… • Funkce stromy: přenos signál. molekul, cytokinů; angiogeneze, metastázování (role MMP, degradace ECM) Základy klinické onkologie Nádorové mikroprostředí • Buňky, molekuly a krevní cévy, které obklopují a vyživují nádorovou buňku, tvoří mikroprostředí nádoru • Parenchym: nádorové buňky, nádorové kmenové buňky • Stroma: fibroblasty, imunitní buňky, endoteliální cévní buňky, ECM, MMP… • Funkce stromy: přenos signál. molekul, cytokinů; angiogeneze, metastázování (role MMP, degradace ECM) Nádorové kmenové buňky (cancer stem cells) • Malé % nádorových buněk • Zodpovědné za chemorezistenci • Overexprese ABC transportérů (MDR) • Teorie: vznik z normálních kmenových buněk mutacemi Zajímavé odkazy https://www.youtube.com/watch?v=xgBjEz_hSCA Čas na hru Kahoot.it