Interfázní FISH na buněčné suspenzi
1. Sklízení buněk
CHEMIKÁLIE
Fixativ - Methylalkohol p.a. a čistou kyselinu octovou ředit v poměru 3:1. Fixativ musí být připraven vždy čerstvý před sklízením buněk! Pro jiné účely lze krátkodobě uchovávat při 4 °C. 75mM KCI - 2,8 g chloridu draselného rozpustit v 500 ml sterilní destilované vody. Uchovávat při 4 °C. Před sklízením předehřát na 37 °C.
SKLÍZENÍ
1. Všechny centrifugace probíhají po dobu 10 minut při 1500 RPM a laboratorní teplotě.
2. Odstranit médium a dvakrát důkladně opláchnout buňky sterilním PBS (37 °C).
3. Převést buňky do suspenze a centrifugovat.
4. Odsát supernatant, pelet důkladně resuspendovat Pasteurovou pipetou a přidat 10 ml 75mM KCI předehřátého na 37 °C. Hypotonizace při 37 °C po dobu cca 30 minut.
5. Přidat 10 kapek fixativu, lehkým obrácením zkumavky promíchat a centrifugovat.
6. Odsát supernatant. Resuspendovat pouze lehkým zatřesením zkumavkou (buňky jsou v této chvíli náchylné k protržení!). Po kapkách přidat 10 ml fixativu. Promíchávat kroužením.
7. Fixace 20 minut při pokojové teplotě. Poté centrifugovat.
8. Odsát supernatant a důkladně resuspendovat Pasteurovou pipetou. Po kapkách přidat 5 ml fixativu.
9. Fixace 10 minut při pokojové teplotě, centrifugovat.
10. Maximálně odsát supernatant. Doplnit fixativem na cca 1 ml (mléčné zakalení suspenze) a uskladnit při teplotě 4 °C.
2. Příprava preparátu
Příprava podložních skel
- Oplach v 70% etanolu, mechanické očištění kartáčkem.
- Oplach v destilované vodě.
- Naložit do skleněné kyvety s 70% etanolem a skladovat při 4 °C.
- Optimální je ponechat skla před použitím takto alespoň přes noc.
Před nakapáním suspenze sklo důkladně utřít do sucha utěrkou na optiku (Micro Optic-Cleaner, Hama).
Příprava krycích skel
- Oplach v 70% etanolu, mechanické očištění, oplach v destilované vodě.
- Utřít do sucha utěrkou na optiku.
Příprava preparátu
Na vychlazené a nadýchnuté podložní sklo kápnout z výšky 1-3 kapky suspenze (dle hustoty suspenze) pod úhlem cca 40 °. Nechat volně schnout - ideálně alespoň do druhého dne.
3. FISH
CHEMIKÁLIE
Ethanolová řada-70%, 80% a 96% ethanol
0,5xSSC (pH 7,2) - zásobní roztok 20xSSC ředit v dH20, upravit na pH 7,2 2xSSC (pH 7) - zásobní roztok 20xSSC ředit v dh^O, upravit na pH 7
FISH - optimalizovaný protokol pro sondy Poseidon™ (Kreatech Diagnostics)
1) Zestaršení preparátu pomocí 2xSSC (Saline-sodium citrate, solný roztok citrátu sodného) při 37°C po dobu 30 minut.
2) Dehydratace v etanolové řadě (70 %, 80 % a 96 %) při laboratorní teplotě, 2 minuty pro každou
koncentraci. ............................................................................................................................□
3) Nechat volně schnout - (ideálně do druhého dne). Poté aplikace sondy. .................................□
Od bodu 4 dále chránit preparát před světlem
4) Na spodní polovinu skla aplikovat 5 u.1 sondy (MYCN, XCE8, XCP8 ), uzavřít krycím sklem a oblepit rámovací hmotou Fixogum.......................................................................................................□
5) Kodenaturace (sondy a DNA preparátu) na kovové plotýnce při teplotě 75°C po dobu 3 minut. .................................................................................................................................................□
6) Hybridizace ve vlhké komůrce přes noc....................................................................................□
Lze nahradit cca 4h hybridizací. Lepší výsledky jsou ale dosaženy hybridizací přes noc.
7) Odstranit rámovací hmotu a opatrně sejmout krycí sklo. □
8) Odmytí nenavázané sondy - 0,5xSSC při 75°C po dobu 2 minut, opláchnutí v 2xSSC při RT po dobu 30s..................................................................................................................................□
9) Nechat oschnout ve tmě...........................................................................................................□
10) Aplikovat 10 u.1 DAPI a hotový preparát uzavřít krycím sklem....................................................□
Fluorescenční detekce cytoskeletálních proteinů
CHEMIKÁLIE
Fixativum - 3% paraformaldehyd v PBS
Permeabilizace - 0,2% triton TX-100 v PBS
Blokovací roztok - 3% BSA (bovinní sérový albumin) v PBS
1. Nepřímá imunocytochemická detekce a-tubulinu (mikrotubuly, MT)
Značení buněk
1) OplachvPBS-2xlmin.....................................................................................................□□
2) Fixace 3% PFA-20 min.........................................................................................................□
3) Permeabilizace 0,2% triton TX-100 - 1 min...........................................................................□
4) Oplach v PBS - 3 x 3 min................................................................................................□ □ □
5) Blokování 2% BSA -10 min (na parafilmu)............................................................................□
6) Inkubace s primární Ab (anti-a tubulin) - 60 min / 37°C (na parafilmu) □
7) Oplach v PBS-3x3 min.................................................................................................
8) Inkubace se sekundární Ab (anti-myší lgG-Alexa488/Alexa568) - 45 min / 37°C (na parafilmu) - lze kombinovat s detekcíF-aktinu viz. krok 5 následující úlohy □
9) Oplach v PBS-3x3 min.................................................................................................
10) Detekce DNA - Hoechst33342 - 3 min..................................................................................□
11) Oplach v PBS - 1 x rychlý, + 1x3 min.....................................................................................□
12) Montovat v montovacím médiu DAKO □
2. přímá detekce F-aktinu
Značení buněk
1) Oplach v PBS-2x1 min.....................................................................................................□□
2) Fixace 3% PFA-20 min.........................................................................................................□
3) Permeabilizace 0,2% triton TX-100 - 1 min...........................................................................□
4) Oplach v PBS - 3 x 3 min................................................................................................□ □ □
5) Inkubace s phalloidin-iFluor488/iFluor555 - 45min / 37°C (na parafilmu) □
6) Oplach v PBS-3x3 min.................................................................................................
7) Detekce DNA - Hoechst33342 - 3 min.................................................................................□
8) Oplach v PBS- 1 x rychlý, + 1x3 min..
9) Montovat v montovacím médiu DAKO
□
Pozorování autofluorescence rostlinného a živočišného původu
MATERIÁL
pylová zrna, listy rostlin, šupiny z motýlího křídla.
Fluorescenční odlišení živých a mrtvých buněk
CHEMIKÁLIE
Hoechst33342 - 1 : 1000 Propidium jodid - 3u.g/ml
Alternativa:
Propidium jodid - 3 u.g/ml Akridinová oranž - 5 u.g/ml
Značení buněk
1) Oplach v PBS.......................................................................................................................□
2) Kapka barvícího roztoku na podložní sklo □
3) Přiklopit krycí sklo s buňkami / inkubace 5 min □