C3807 Cvičení z chemie přírodních polymerů Návody k laboratorním úlohám Radka Bačovská, Světlana Filípková, Pavla Hanáčková, Ladislav Pospíšil Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Návody k úlohám Cvičení z chemie přírodních polymerů, C3807, vznikly díky finanční podpoře v rámci projektu FRMU 2017. Všechny úlohy byly odzkoušeny v laboratořích Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity. Cvičení je také doplněno o exkurzi na CEITEC VUT. Studenti se ve cvičení seznámí s běžnými i moderními trendy v oblasti přírodních polymerů. Cvičení souvisí s předmětem C3804 Přírodní polymery. Úlohy vychází jak z převzatých úloh z UTB, UP, UK, tak naprosto nových. Teoretické úvody představují základní představení obecné skupiny polymerních látek. Při provádění úloh je třeba dbát zvýšené opatrnosti a striktně dodržovat uvedená bezpečnostní pravidla. Ve cvičeních se bude pracovat s nebezpečnými a dráždivými látkami. Před zahájením samotného chemického procesu musí být aparatura zkontrolována vyučujícím. Studenti jsou povinni seznámit se s bezpečnostními pravidlo pro nakládání s chemikáliemi (např. bezpečnostní listy na stránkách Sigma Aldrich, Acros Organics apod.). 2 Obsah Návody k laboratorním úlohám............................................................................................................1 SACHARIDY............................................................................................................................................5 Úloha č. 1: MONO-, OLIGO- A POLYSACHARIDY.................................................................................12 A. KVALITATIVNÍ REAKCE SACHARIDŮ.............................................................................................12 a. Thymolová reakce - důkaz sacharidů 1.....................................................................................13 b. Molischova reakce - důkaz sacharidů II...................................................................................13 c. Nitrochromová reakce - důkaz mono- a oligosacharidů..........................................................13 d. Jodový test - důkaz polysacharidu (rozlišení škrobu a celulózy)..............................................14 e. Fehlingova reakce - rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů 1..................................14 /. Tollensova zkouška - rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů II...............................15 g. Selivanova reakce - roližení aldóz a ketóz 1..............................................................................16 h. Reakce s močovinou - odlišení aldóz a ketóz II........................................................................16 ;'. Barfoedova reakce - důkaz monosacharidů............................................................................17 j. Bialova reakce - důkaz pentóz a hexóz....................................................................................17 Úloha č. 2: POLYSACHARIDY - ŠKROB.................................................................................................19 A. STANOVENÍ ŠKROBU GRAVIMETRICKY.................................................................................19 B. DĚLENÍ ŠKROBU NA AMYLOSU A AMYLOPEKTIN.................................................................21 C. DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI ŠKROBU A SOLANINU V HLÍZÁCH BRAMBOR...................................22 D. ENZYMATICKÁ HYDROLÝZA ŠKROBU....................................................................................23 Úloha č. 3: DŘEVO A POLYSACHARID CELULOSA................................................................................24 A. STANOVENÍ ROZPUSTNOSTI CELULOS V HYDROXIDU SODNÉM..........................................24 B. STANOVENÍ VLHKOSTI DŘEVA..............................................................................................25 C. PŘÍPRAVA NITRÁTU CELULOSY.............................................................................................26 D. SIMULACE VÝROBY PERGAMENOVÉHO PAPÍRU..................................................................27 E. STANOVENÍ VLHKOSTI CELULOSY.............................................................................................28 F. STANOVENÍ LIGNINU VE DŘEVĚ (metoda podle Komárova)....................................................29 G. STANOVENÍ a CELULOSY (metodou dle Klauditze)...............................................................30 H. STANOVENÍ PODÍLU HOLOCELULOSY VE DŘEVĚ (metoda podle Wise)...............................31 I. STANOVENÍ a CELULOSY (metodou dle Tappiho)....................................................................32 TUKY, OLEJE, VOSKY............................................................................................................................33 Úloha č. 4: TUKOVÉ CHARAKTERISTIKY..............................................................................................34 A. PEROXIDOVÉ ČÍSLO...............................................................................................................34 B. JODOVÉ ČÍSLO-Hanušova metoda.....................................................................................36 C. ČÍSLO KYSELOSTI...................................................................................................................38 3 D. ČÍSLO ZMÝDELNĚNÍ..............................................................................................................40 E. ČÍSLO ESTEROVÉ.......................................................................................................................41 BÍLKOVINY A AMINOKYSELINY............................................................................................................42 Úloha č. 5: DŮKAZ BÍLKOVIN A AMINOKYSELIN.................................................................................43 A. BIURETOVÁ REAKCE - důkaz bílkovin...................................................................................43 B. XANTOPROTEINOVÁ REAKCE...............................................................................................44 Úloha č. 6: KYSELÁ HYDROLÝZA BÍLKOVIN (denaturace kolagenu na klíh).........................................50 Úloha č. 7: VÝROBA GALALITU Z KASEINU..........................................................................................51 Úloha č. 8: STANOVENÍ AMINOKYSELIN / BÍLKOVIN..........................................................................52 A. STANOVENÍ AKTIVNÍ KYSELOSTI MLÉČNÝCH VÝROBKŮ.......................................................52 B. TITRAČNÍ STANOVENÍ KYSELOSTI MLÉČNÝCH VÝROBKŮ (Soxhlet-Henkelova metoda.......52 C. STANOVENÍ BÍLKOVIN V MLÉCE (Pyneho metoda)...............................................................54 D. STANOVENÍ BÍLKOVIN V MLÉCE (metoda dle Schulze).........................................................55 E. STANOVENÍ POPE LA V KASEINU...............................................................................................56 F. STANOVENÍ OBSAHU TUKU V KASEINU....................................................................................57 G. ORIENTAČNÍ STANOVENÍ VISKOSITY KASEINU.....................................................................58 Úloha č. 9: MEĎNATÉ HEDVÁBÍ..........................................................................................................59 MODERNÍ TRENDY V POLYMERNÍ CHEMII..........................................................................................61 Úloha č. 10: ELEKTROSTATICKÉ NANOZVLÁKŇOVÁNÍ PŘÍRODNÍCH POLYMERŮ...............................61 Úloha č. 11: 3D TISK PŘÍRODNÍCH POLYMERŮ...................................................................................63 4 SACHARIDY SACHARIDY (glycidy) jsou rozsáhlou a velmi pestrou skupinou přírodních látek patřících do skupiny polyhydroxyderivátů karbonylových sloučenin s minimálně třemi atomy uhlíku. Sacharidy jsou z chemického hlediska hydroxy aldehydy (aldózy), které mají navázaný jeden řetězec a jeden atom H, nebo hydroxyketony (ketózy), které mají navázané dva různé řetězce. Společný sumární vzorek všech sacharidů je (CH20)«, kde n>3. Aldosy se díky přítomnosti aldehydické skupiny mohou oxidovat nebo redukovat (Obr. 1). H0^° CH2OH H—C—OH H—C—OH H—C—OH i HO C H ^ oxidace HO—C—H redukce HO—C—H H—C—OH H—C—OH H—C—OH H—C—OH H—C—OH H—C—OH CH2OH CH2OH CH2OH kyselina D-glukonová D-glukosa D-glucitol Obr. 1: Oxidace a redukce aldosy Primárně vznikají fotosyntézou. Monosacharidické jednotky se mohou spojovat do vyšších útvarů přes tzv. glykosidovou vazbu. Ke spojení do vícecyklických sacharidů dochází kondenzací (Obr. 2), tedy odštěpením vody. Naopak rozklad těchto sloučenin probíhá opačným procesem, tedy hydrolýzou (Obr. 2). Obr. 2: Vznik a rozklad polysacharidu Podle počtu sacharidových jednotek rozdělujeme monosacharidy, oligosacharidy (2-10 molekul) a polysacharidy. Sacharidy lze rozdělit na redukující a neredukující sacharidy. Redukující sacharidy obsahují volnou aldehydovou nebo ketonovou funkční skupinu a mohou fungovat jako redukční činidla. Ketózy se nejprve musí tautomerizovat na aldózy a až pak mají redukční účinky. Redukující jsou všechny monosacharidy a patří tak mezi aldózy. Některé di- (laktóza, maltóza), oligo- i polysacharidy (mají-li poloacetátový hydroxyl). Neredukující sacharidy (sacharóza) nemají poloacetal a zůstávají tak v cyklické formě Nízkomolekulární sacharidy (mono- a oligo-) jsou rozpustné ve vodě a mají více či méně sladkou chuť a lze je označit jako cukry (na potravinách označovány kategorií „z toho cukry"). Makromolekulami polysacharidy jsou většinou bez chuti a jsou ve vodě jen omezeně rozpustné (škrob, agar), nebo zcela nerozpustné (celulóza a jiné neškrobové polysacharidy z vlákniny). Rostliny jsou schopny je vyrábět fotosyntézou zvody, CO2 a sluneční energie. Ostatní organismy jsou závislé na jejich příjmu. 5 Sacharidy mají několik funkcí: - zdroje energie (glukóza, fruktóza) - díky jednoduché struktuře jsou nej rychlejším zdrojem energie, na rozdíl od lipidů a proteinů). - zásobní látky (inulin, škrob) stavební funkce - řetězením do dlouhých řetězců (polysacharidy) vzniká např. celulóza, která tvoří buněčnou stěnu většiny rostlin. složky složitějších látek (nukleové kyseliny, hormony, koenzymy) MONO SACHARIDY (z řečtiny monos: jednoduchý, sacchar: cukr) jsou základní stavební jednotky všech sacharidů. Jsou charakteristické tím, že se nedají štěpit na sacharidy jednodušší. Monosacharidy jsou typicky krystalické látky dobře rozpustné ve vodě a v polárních rozpouštědlech. Monosacharidy jsou chirální sloučeniny, to znamená, že jsou opticky aktivní a stáčejí rovinu polarizovaného světla. Podle počtu uhlíků se dělí na triosy, tetrosy, pentosy a hexosy. Monosacharidy lze zapsat ve formě lineární (vyjádřené Fisherovým vzorcem, viz Obr. 3) a cyklické (vyjádřené Haworthovým vzorcem, viz Obr. 4). Fisherův vzorec je vhodný, chceme-li vidět orientaci jednotlivých funkčních skupin (Obr. 3). HC^ CH-OH I HC—OH I HC—OH I H2C —OH D-ribóza H,C 'I -OH hc; I ;0 HC*=° CH-OH 6=0 CH-OH HO—CH I I I HO—CH HO—CH HO— CH HO—CH I I I I HC—OH HC—OH HO—CH HC —OH HC I ho—ch "ch I I ch-oh ho—ch I h c—c HC ^0 ch ch-oh ho—ch hc-oh ho-ch h0^h2 h2c_oh hc—oh I hc—oh I hc —oh I HC —OH I hc—oh ho—ch I I D-glyceraldehyd H2C—OH H2C—OH H2C —OH H2C—OH H2C—OH HO-CH L-qlyceraldeŕ D-qlukóza D-fruktóza D-galaktóza D-manóza D-glukóza L-qlukóza Obr. 3: Přehled základních lineárních monosacharidů - Fisherův vzorec Haworthův vzorec znázorňuje skutečnou, cyklickou strukturu sacharidů (Obr. 4) ChSOH H ,0, OH HO--H /Ov H CH?OH H OH p-glukofuranosa OH HO H OH a-D-glukofuranosa CH2OH CH20H OH H H HO H OH p-glukopyranosa H OH a-glukopyranosa Obr. 4: Cyklické monosacharidy - Haworthův vzorec U obou forem představují jednotlivé uhlíky asymetrická centra způsobující optickou aktivitu jedná se o tzv. chirální centra. Díky nim existuje velké množství stereoizomerů 1 Orientace hydroxylových skupin a atomů uhlíku v Haworthově vzorci se určuje tak, že je-li daná částice zapsaná ve Fischerově vzorci vpravo, nachází se v Haworthově dole. Pokud je částice ve Fischerově vzorci zapsána vlevo, píše se v Haworthově nahoru. 6 (prostorových izomerů) se stejným sumárním vzorcem. Jejich maximální počet je 2" (n = počet chirálních center). Dvojice stereoizomerů, které jsou vzájemně právě zrcadlovými obrazy, nazýváme enantiomery a označujeme je stejným názvem doplněným symbolem L- (levotočivý) nebo D- (pravotočivý). Podle orientace -OH skupiny na posledním stereogenním uhlíku ve Fischerově projekci tedy rozlišujeme L-cukry (orientované doleva) a D-cukry (orientované doprava). V roztoku existují převážně v cyklických formách, přičemž formy s pětičlenným kruhem označujeme jako furanosy (konformačně flexibilnější, preferují obálkové konformace). Šestičlenné kruhy nazýváme pyranosy (nejčastěji v židličkových konformacích). Při uzavření cyklické formy dochází k vzniku dvou anomerů, které rozlišujeme za pomoci anomerních konfiguračních symbolů a a p Nej důležitějšími monosacharidy (Obr. 3) jsou: D-glukóza (hroznový cukr) - obsažena ve sladkých plodech, medu, hroznech; primární produkt fotosyntézy, základní sacharid, průmyslově se vyrábí ze škrobu D-fruktóza (ovocný cukr) - nej sladší, obsažena v medu, získává se z polysacharidu inulinu D-ribóza - složka kyseliny ribonukleové OLIGOSACHARIDY vznikají kondenzací 2-10 monosacharidových jednotek, konkrétně glykosidovou vazbou za odštěpení vody. Disacharidy se dělí dle typu glykosidové vazby na redukující a neredukující. Redukující disacharidy (laktózy, maltóza) jsou spojeny na 1,4 a 1,6 koncích. Neredukující sacharidy (sacharóza) jsou spojeny vazbami na 1,1 a 1,2 koncích. Podle počtu monosacharidových jednotek vázaných v jejich molekulách rozlišujeme disacharidy, trisacharidy, tetrasacharidy atd. Hydrolýzou se z nich opět uvolňují monosacharidy. Nej důležitějšími z di sacharidů jsou: maltóza (sladový cukr) (Obr. 5) - vzniká dehydratací 2 glukózových jednotek glykosidovou vazbou a Cl—>C4 (je tedy redukující); získává se enzymatickou hydrolýzou škrobu laktóza (mléčný cukr) (Obr. 6) - vzniká spojením glukózy a galaktózy vazbou P Cl—>C4 (redukující); je obsažen v mléce savců (4-7 %) sacharóza2 (řepný, třtinový cukr) (Obr. 7) - vzniká glykosidovou vazbou mezi glukózou a fruktózou, vazba a,P Clgiuk—>-C2fruk (neredukující); nej rozšířenější disacharid obsažený ve všech rostlinách; hydrolýzou vzniká D-glukóza a L-fruktóza = invertní cukr; v rostlinách se mění na škrob, případně se ukládá jako jako zásobní látka; získává se z cukrové řepy a třtiny 2 Anglicky je sacharóza SUCROSE! Někdy se mylně uvádějí jako neredukující cukry sukróza a sacharóza. To je pustý omyl, kdy si autoři nepřeložili do češtiny název SUCROSE. 7 HO OH CH2OH CH2OH OH Obr. 6: Laktóza Obr. 5: Maltóza Obr. 7: Sacharóza Produkty jejich hydrolýzy obsahují více redukujících sacharidů, zastoupení redukujících sacharidů v těchto produktech se nazývá dextrózový ekvivalent (DE). POLYSACHARIDY jsou nej rozšířenějšími přírodními polymery. Jsou složeny z mnoha monosacharidových jednotek (řádově 10-100 000) s vysokou Mr. Vznikají spojením monosacharidových jednotek vždy přes poloacetalový hydroxyl (nemají redukční účinek). Hydrolýzou dochází ke štěpení na monosacharidy, které opět mají redukční schopnost. Mají obecný sumární vzorec Cn(H20)n-i. Molekula sacharidu složená pouze z jednoho druhu monosacharidu se označuje jako homopolysacharid. Pokud obsahuje různé monosacharidy označuje se jako heteropolysacharid. Nemají sladkou chuť a nenazývají se proto cukry, ve vodě jsou jen těžko rozpustné nebo častěji nerozpustné. Mají funkci především stavební (celulóza) a zásobní (škrob). Nejvýznamněj ší polysacharidy j sou: škrob - viz níže celulóza - viz níže glykogen (živočišný škrob) - složený z a-D-glukopyranózových jednotek, struktura je podobná amylopektinu ale větveněj ší; zásobní polysacharid živočichů (uložen především v játrech a svalech) a hub; rozpustný ve vodě chitin inulin heparin, aj. Škrob je nej důležitější produkt metabolismu rostlin a zásobní polysacharid rostlin. V našem zeměpisném pásmu je spojován hlavně s bramborami, ale celosvětově je nej důležitější plodinou pro výrobu škrobu kukuřice. V rostlinách se vyskytuje jako heterogenní částice, nikoli jako rozpuštěná látka. Podle druhu plodiny má různý tvar a velikost (Obr. 8). Některé plodiny (např. pšenice) mají zrna dvou různých velikostí. brambora pšenice Obr. 8: Zrna různých škrobů rýze kukuřice 8 Chemicky je škrob poly (l,4)a-D-glukopyranosa s obecným sumárním vzorcem (CôHioOs^. Je směsí makromolekul amylózy (10-20 %) a amylopektinu (80-90 %) jejichž vzájemný poměr se liší dle druhu rostliny.. Amylóza (Obr. 9) má lineární nebo šroubovicovité uspořádání, obsahuje několik set glukózových jednotek, je rozpustná a s jódem se barví modře3. Amylopektin (Obr. 10) tvoří rozvětvené molekuly obsahující několik tisíc glukózových jednotek, nerozpustný sacharid obsahující další glykosidovou vazbu (l,6)a. Obr. 10: Amylopektin Škrob lze chemicky (kyselá hydrolýza) i enzymaticky (amyláza) štěpit v hlavním řetězci na oligosacharidy (např. maltóza) až monosacharidy. Štěpení chemické je obvykle kysele katalyzované běžnými anorganickými kyselinami (HC1, H2SO4). Využívá se k výrobě obalového papíru, lepenky, lepidel, sádrokartonových desek, škrobení prádla. V současnosti se začíná využívat jako „bioplast" a začínají se z něj vyrábět např. kompostovatelné obaly (sáčky, tašky) Celulóza je nej rozšířenějším BIOPOLYMEREM na zemském povrchu. Tvoří základní stavební složku rostlin. Celulóza je tvořena molekulami B-D-glukopyranózy spojenými pomocí B-1,4 glykosidové vazby (Obr. 11) do lineární struktury s množstvím vodíkových můstků. OH Vazba p-1,4 >. OH Obr. 11: Ji-D-Glukóza, ji-1,4 glykosidová vazba Podílí se na buněčné stavbě stěn mikroorganismů (Obr. 12). Pro živočichy je nestravitelná, ale v potravě má význam ve formě vlákniny. Díky vláknité nadmolekulární struktuře má celulóza velkou pevnost. Celulóza je hygroskopická. Její rozpustnost je velmi omezená a často při ní dochází ke štěpení hlavního řetězce. Hlavní řetězec celulózy lze štěpit chemicky (kyselá katalýza) i enzymaticky (enzym celuláza). Rozpustnost závisí na molekulové hmotnosti celulózy. Kratší molekuly celulózy, často substituované a větvené, se nazývají hemicelulózy. Hemicelulóza tvoří rovné, lineární řetězce obsahující pentózy i hexózy. Doprovází celulózu 3 K tomuto jevu dochází, protože velikost dutiny šroubovice amylózy odpovídá velikosti molekuly jódu h se kterou tvoří barevný komplex 9 v jednotlivých vrstvách buněčné stěny rostlin. Tvoří tmelící vrstvu mezi celulózními řetězcovými makromolekulami, váže se na ni lignin. Ze dřeva je lze extrahovat pomocí zředěných bází a snadno hydrolyzovat zředěnými kyselinami za tepla. Piant ceils ' 0,5 um Copymrit* Pe-BíHXi Educalion. Inc.. pubhshing as Benpmm Cviihtiíiiiis Obr. 12: Stavba dřeva Lignin je vysokomolekulárni polyfenolická amorfní látka. Základní stavební jednotkou jsou deriváty fenylpropanu, které jsou vázány do trojrozměrných struktur etherovými vazbami nebo vazbami mezi dvěma uhlíky. Je kovalentně vázán na polysacharidy. Lignin zabezpečuje dřevnatění buněčných stěn. Při využití dřeva jako paliva množství ligninu určuje jeho výhřevnost. Chemickou stavbu dřeva tvoří ze 40-50 % celulóza, 20-30 % hemicelulóza, 20-30 % lignin, 1-15 % dalších organických látek (terpeny, tuky, vosky, třísloviny, pektiny, steroly, pryskyřice), 0,1-0,5 % anorganických látek a voda. Obsah jednotlivých látek se liší v závislosti na druhu suroviny, viz Tab. 1. Celulóza a hemicelulóza patří mezi polysacharidy a bývají souhrnně označovány jako holocelulóza. Lignin je vysokomolekulárni látka. Tab. 1: Složení bavlny, listnatého a jehličnanového dřeva Komponenta Bavlna [%1 Jehličnaté dřevo [%1 Listnaté dřevo [%1 Celulosa 90-94 50-58 52-54 Pentosa 1,5-2,0 11,0 25,0 Lignin 2,0-3,0 26,0-28,0 17,0 Pektínové látky 2,0 1,0 1,5-2,0 Bílkoviny 1,5-2,0 0,5-0,8 0,5-0,8 Tuky a vosky 0,5-1,0 1,0-2,0 1,0-2,0 Popel 1,0 0,25-0,5 0,25 Celulóza se pro komerční účely izoluje ze dřeva odstraněním ostatních složek (ligninu, hemicelulózy, olejů). Celulózová vlákna se používá v papírenském a textilním průmyslu. Celulóza je hlavní složkou buničiny, z níž se vyrábí papír, a rostlinných vláken z bavlny, lnu a konopí. 10 Jejími deriváty jsou: acetáty celulózy - acetylací na C6 vzniká acetátové hedvábí; reakcí s NaOH a CS2 vzniká xantoghenát používaný k výrobě celofánu a viskózového hedvábí dinitrát celulózy (koloidová vlna) - smísením nitroglycerinem vzniká třaskavá želatina, reakcí s kafrem vzniká celuloid - trinitrát celulózy (střelná bavlna) - nitrovaná celulóza je výbušná a vysoce hořlavá, používá se k výrobě granátů, min, bezdýmých střelných prachů 11 Úloha č. 1: MONO-, OLIGO- A POLYSACHARIDY A. KVALITATIVNÍ REAKCE SACHARIDŮ Cílem kvalitativních reakcí je rozdělení sacharidů dle jejich chemického složení. Jednotlivé reakce provádějte v návaznosti dle Schéma 1: Postup kvalitativních reakcí sacharidů Vzorek Thymolová nebo Molischova reakce + = obsahuje sacharid " -=~neobsahujesacharid Nitrochromová reakce + = mono-, oligo- Fehlingova neboTollensova reakce < -= poly Lugollova reakce + = škrob - = celulóza neredukujíci + = redukující Selivanova reakce nebo ^ +=ketózy reakce s močovinou \ * - = aldózy Barfoedova reakce < + = monosacharid ■ = oligo- a polysacharidy Bialova reakce ^ modrá = pentózy ^ Hne Teda - zelená = hexózy Schéma 1: Postup kvalitativních reakcí sacharidů Pomůcky: Zkumavky, lžičky, špachtle, pipetky, kádinky, stojan, žíhací kruh, síťka, vodní lázeň (vařič a kádinka). Vzorky: Vzorky sacharidů - glukóza, fruktóza, sacharóza, laktóza, ribóza, dextrin, škrob, aj. Závěr: Do tabulky (Tab. 2: Tabulka výsledků kvalitativních zkoušek jednotlivých vzorků) uveďte rekci každého vzorku. Vyplněnou tabulku uveďte to protokolu s popisem vlastních pozorování. 12 a. Thymolová reakce - důkaz sacharidů I. Princip: Účinkem koncentrované HC1 na monosacharidy dochází k dehydrataci a vzniku furfuralu či jeho derivátů. Furfural i jeho deriváty podléhají kondenzaci s fenoly (thymol) za vzniku barevného produktu. Sacharidy poskytují reakcí s roztokem thymolu v přítomnosti HC1 tmavočervené až purpurové sloučeniny Chemikálie: Koncentrovaná HC1, 5% (w/v) ethanolový roztok thymolu, NaCl Pracovní postup: 1. Do několika zkumavek nasypte na špičku špachtle různých druhů pevných sacharidů a rozpusťte v destilované vodě. V případě kapalného sacharidu nalijte vzorek do zkumavky. 2. Do zkumavek se vzorky přidejte asi 5 kapek roztoku thymolu, 10 cm3 kone. HC1 a několik krystalků NaCl. 3. Zkumavku umístěte do vodní lázně a mírně zahřívejte, dokud nedojde ke změně barvy. 4. Připravte slepý vzorek - místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu. 5. Určete neznámý vzorek - podle bodu 1.-3. určete zda vzorek obsahuje sacharid. b. Molischova reakce — důkaz sacharidů II. Princip: Účinkem koncentrované HC1 na monosacharidy dochází k dehydrataci a vzniku furfuralu či jeho derivátů. Furfural i jeho deriváty podléhají kondenzaci s fenoly (1-naftol) za vzniku barevného produktu. Sacharidy poskytují reakcí s Molischovým činidlem fialový prstenec na rozhraní koncentrované H2SO4 a roztoku sacharidu. Chemikálie: Molischovo činidlo - 3% ethanolický roztok 1-naftolu; koncentrovaná H2SO4 Pracovní postup: 1. Ke 2 ml roztoku vzorku ve zkumavce přidejte 5 kapek Molischova činidla a protřepejte. 2. Podvrstvěte 2 ml kone. H2SO4 (kyselinu nechte opatrně stékat po stěně zkumavky) 3. Na rozhraní kyseliny a sacharidu vznikne intenzivně zbarvený (červený, červenofialový, fialový, modrý až hnědý) prstenec. 4. Zamícháním se kapalina zbarví tmavě fialově; zředěním vodou se vyloučí modrofialová sraženina rozpustná v etheru za vzniku žlutého roztoku. 5. Připravte slepý vzorek - místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu. 6. Určete neznámý vzorek - podle bodu 1 -4. určete zda vzorek obsahuje sacharid. Pozn.: reakce není specifická jen pro sacharidy a ovlivňují ji např. nečistoty v l-naftolu (zelené zbarvení) nebo přítomnost bílkovin ve vzorku (bílý pruh). c. Nitrochromová reakce — důkaz mono- a oligosacharidů Princip: Reakcí koncentrované kyseliny dusičné a chromanu draselného se sacharidem dochází k oxidaci mono- a oligosacharidů. Chroman (Cr+6) se redukuje na modře zbarvené kationty 13 chromnaté (Cr ). Sekundární alkoholická skupina sacharidu reaguje s chromanem v kyselém prostředí za vzniku modrého zbarvení. Polysacharidy nereagují. Chemikálie: Konc. HN03, 5% (w/v) roztok K2Cr04 Pracovní postup: 1. Ke 2 ml vzorku sacharidu přidejte asi 3 ml kone. HNO3 a 5 kapek roztoku K2Cr04. 2. Po chvíli (cca2 min) pozorujte vznik modrého zabarvení 3. Připravte slepý vzorek - místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu. 4. Určete neznámý vzorek - podle bodu 1.-2. určete, zda neznámý vzorek obsahuje polysacharid. Pozn.: z polysacharidu reaguje inulin a škroby, kdy po delší době dochází k hydrolýze. Hydrolýzou vzniklé mono- a oligosacharidy pak poskytují pozitivní reakci d Jodový test —důkaz polysacharidu (rozlišení škrobu a celulózy) Princip: Škrob i celulóza j sou polysacharidy složené tisíce jednotek molekuly glukózy. Škrob se skládá ze dvou různých polysacharidu (amylóza a amylopektin). Škrob reaguje s Lugolovým roztokem za vzniku modrého zbarvení, které zahřátím mizí. Chemikálie: Lugolův roztok - 5 g I2 a 10 g KI v 85 ml destilované vody Pracovní postup: 1. Ke 1 ml roztoku sacharidu přidejte asi 1 kapku Lugolova roztoku. 2. Po chvíli pozorujte vznik modrofialového až modročerného zabarvení. 3. Zkumavku zahřejte k varu dokud se směs neodbarví. 4. Po ochlazení se opět objeví modré zbarvení 5. Připravte slepý vzorek - místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu. 6. Určete neznámý vzorek - podle bodu 1 -2. určete, zda neznámý vzorek obsahuje škrob. e. Fehlingova reakce — rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů I Princip: Oxidačně - redukční reakce probíhá pouze u skupiny tzv. redukujících cukrů. To jsou takové cukry, které mohou mít v otevřené formě volnou, oxidace schopnou, karbonylovou skupinu. Může jít jak o monosacharidy, tak disacharidy, trisacharidy či vyšší mery sacharidů. Má-li dojít k viditelné reakci (změna barvy sloučeniny mědi z modré na žlutočervenou), musí být v roztoku dostatečná koncentrace koncových merů, které mohou mít v otevřené formě volnou, oxidace schopnou, karbonylovou skupinu. Pokud tomu tak není, jedná se o tzv. cukr neredukující. Oxidačně - redukční reakce obvykle probíhá pouze do stupně redukce Cu+2 (Rov. 1) na Cu+1. V případě vyšší koncentrace redukujícího sacharidu může dojít k redukci až na Cu (Rov. 2). 2 -COH + 02 + 2 Cu+2 -> -COOH + 2 Cu+1 Rov. 1 2 -COH + 02 + 2 Cu+1 -> -COOH + 2 Cu Rov. 2 14 HO \ I CH-OH CH-OH | I HO—CH H0 9H HC—OH + 2Cu2*+40H"-HC—OH + Cu2° +2Hp HC—OH HC—OH | I_ H2C—OH H2C 0H Obr. 13: Princip Fehlingovy reakce Chemikálie: Fehlingovo činidlo I: 4 g C11SO4 5H2O rozpusťte v destilované vodě a doplňte na 100 ml. Fehlingovo činidlo II - 20 g KNaC4H40ô 4H2O a 15 g NaOH rozpusťte v destilované vodě a doplňte na 100 ml. Pracovní postup: 1. Do několika zkumavek nasypte na špičku špachtle různých druhů pevných sacharidů a rozpusťte v destilované vodě. V případě kapalného sacharidu nalijte vzorek do zkumavky. 2. Do zkumavek se vzorky přidejte 1 ml roztoku Fehling I a 1 ml roztoku Fehling II. 3. Zkumavku umístěte do vodní lázně a zahřívejte, dokud nedojde ke změně barvy. 4. Připravte slepý vzorek - místo sacharidu nalijte pouze destilovanou vodu. 5. Určete neznámý vzorek - podle bodu 1.-3. určete neznámý vzorek (redukující x neredukující) / Tollensova zkouška — rozlišení redukujících a neredukujících sacharidů II Princip: Tollensovo činidlo (dusičnan diamminstříbrný [Ag(NH3)2]N03) vzniká reakcí dusičnanu stříbrného a koncentrovaného roztoku hydroxidu amonného za vzniku amonného komplexu (Rov. 3 a Rov. 4). Reakcí Tollensova činidla s aldehydickou skupinou sacharidů vzniká amonná sůl karboxylové kyseliny a redukované stříbro (Rov. 5). Pozitivní reakce činidla s redukujícím cukrem se projeví vznikem tzv. stříbrného zrcátka na stěnách zkumavky. 2 AgN03 + 2 NaOH -> Ag20 (s) + 2 NaN03 + H20 Rov. 3 Ag20 (s) + 2 NaN03 + 4 NH4OH -> [Ag(NH3)2]N03 + 2 NaOH + 4 H20 Rov. 4 2 Ag+[NH3]° + R-HCO -> 2 Ag° + R-COO NH4+ + 2 NH3 + H20 Rov. 5 HO HC=^ 9 \ I CH-OH CH-OH HO—CH HO—CH HC—OH +2"«"+20H'-~ HC—OH + Ag + Hp HC —OH H9 0H I I H2C — OH H2C—OH Obr. 14: Princip Tollensovy reakce Chemikálie: 5% roztok AgN03 v H20, 10% NaOH v H20, koncentrovaný NH4OH H20 Pracovní postup: 1. Tollensovo činidlo připravte smísením stejného objemu roztoku AgN03 a NaOH (Rov. 3). Následně do zkumavky přidejte koncentrovaný NH4OH přičemž se hnědá sraženina Ag20 15 rozpustí (Rov. 4). Delším stáním ve směsi může vznikat velmi výbušné Bertholetovo třaskavé stříbro Ag3N! 2. Do několika zkumavek připravte vzorky sacharidů ve formě vodného roztoku. 3. Ke vzorkům sacharidů ve zkumavkách přikápněte Tollensovo činidlo. 4. Za přítomnosti redukujícího cukru dojde dle Rov. 5 ke vzniku stříbrného zrcátka. 5. Porovnejte se slepým vzorkem. Místo vzorku sacharidů nadávkujte pouze vodu. 6. Určete neznámý vzorek g. Selivanova reakce — rolijení aldóz a ketóz I. Princip: Podstatou reakce je dehydratace sacharidů koncentrovanými kyselinami na 5-(hydroxymethyl)fural, který následně reaguje s resorcinolem za vývoje třešňově červeného produktu (Obr. 5). ^-^•oh ch2oh Obrázek 1: Princip Selivanovy reakce Cílem reakce je rozlišení ketos (např. fruktóza) a aldos (např. glukosa). Ketosy reagují rychleji než aldosy. Aldosy poskytují pouze slabě růžové zbarvení kvůli pomalejší dehydrataci, kdy nejprve dochází k izomerizaci aldosy na ketosu. Reakce aldos je asi 20x pomalejší. Pozitivní výsledek poskytuje fruktóza a sacharóza zatímco glukóza nereaguje. Chemikálie: Selivanovo činidlo: 0,05 g resorcinolu se rozpustí ve směsi 50 cm3 HC1 a 50 cm3 H2O Pracovní postup: 1. Ke vzorkům sacharidů ve formě roztoku (cca 1 cm3) přidejte cca 2 cm3 Selivanova činidla. 2. Sledujte změnu zbarvení 3. Porovnejte se slepým vzorkem 4. Určete neznámý vzorek h. Reakce s močovinou — odlišení aldóz a ketóz II Chemikálie: Močovina, kone. HC1 Pracovní postup: 1. Do zkumavky odvažte asi 0,5 g močoviny a přidejte 6 kapek HC1. 2. Ke směsi přidejte 3 kapky roztoku sacharidu. 3. Reakční směs promíchejte, aby se močovina rozpustila 4. Zkumavku zahřívejte 15 min na vodní lázni. 16 5. Sledujte změnu zbarvení - aldózy reagují vývojem zelenomodrého zbarvení, ketózy se barví červeně. 6. Porovnejte se slepým vzorkem 7. Určete neznámý vzorek i. Barfoedova reakce — důkaz monosacharidů Princip: Roztoky sacharidů reagují s barefeodovým činidlem červenohnědou sraženinu Octan meďnatý se v kyselém prostředí redukuje na oxid měďný (červená sraženina) a zároveň dochází k oxidaci monosacharidů na příslušné aldonové kyseliny (např.: glukosa - k. glukonová). Aldehydová skupina se oxiduje na karboxylovou skupinu, zatímco skupina -CH2OH zůstává zachována. Přednostně se redukují monosacharidy. Všechny monosacharidy mají redukční účinky, protože mají volnou aldehydovou skupinu (aldosy), nebo je možná izomerizace ketoskupiny na aldoskupinu (ketosy)), až po delší době reagují redukující disacharidy. Reakce sacharidů s Barfoedovým činidlem je podobně jako reakce sacharidů s Fehlingovým činidlem založena na redukci Cu2+ na Q12O (oranžová či červená sraženina). Redukce Cu2+ v Barfoedově testu probíhá v kyselém prostředí (kyselina octová), na rozdíl nebo Fehlingova testu, kdy Cu2+ se redukují v zásaditém prostředí hydroxidu sodného Chemikálie: Barfoedovo činidlo: 7 g octanu meďnatého Cu(CH3COO)2 a 0,9 ml konc. Kyseliny octové CH3COOH se doplní po 100 ml destilovanou vodou. Pracovní postup: 1. Ke 2 ml roztoku sacharidu přidejte 2 ml Barfoedova činidla. 2. Zkumavku ponořte do vodní lázně. 3. Sledujte změnu zbarvení - monosacharidy reagují vznikem červené sraženiny, ostatní roztoky j sou modré. 4. Porovnejte se slepým vzorkem 5. Určete neznámý vzorek Pozn.: reakce je specifická na důkaz redukujících monosacharidů, redukující disacharidy vzhledem k slabě kyselé povaze Barfoedova činidla pozitivní reakci neposkytují vůbec nebo až po delší době. j. Bialova reakce — důkaz yentóz a hexóz Princip: Bialova reakce odlišuje pentózy a hexózy. Dehydratací pentózy (5-uhlíkový sacharid) vzniká furfural, který reaguje s Bialovým činidlem za vzniku modrého kondenzačního produktu. Dehydratací hexózy (6-uhlíkový sacharid) vzniká 5-hydroxymethylfurfural reaguje s Bialovým činidlem za vzniku hnědého, červenohnědého nebo zeleného kondenzačního produktu. 17 OH Pentose Blue-Green Complex furfural OH Hexose Brown Complex 5-hydroxymethyl furfural Obr. 15: Princip Bialovy reakce Chemikálie: Bialovo činidlo: 6,25 mgFeCb + 0,75 g orcinol (5-methylbenzen-l,3-diol CH3C6H3(OH)2 + 250 ml kone. HC1 Pracovní postup: 1. K 1 ml Bialova činidla přidejte 5-6 kapek roztoku sacharidu. 2. Zkumavku zahřejte k varu. 3. Sledujte změnu zbarvení (2-3 min) Porovnejte se slepým vzorkem 4. Určete neznámý vzorek Pozn.: reakce je specifická na důkaz redukujících monosacharidů, redukující disacharidy vzhledem k slabě kyselé povaze Barfoedova činidla pozitivní reakci neposkytují vůbec nebo až po delší době. Tah. 2: Tabulka výsledků kvalitativních zkoušek jednotlivých vzorků Vzorek/ Činidlo Dextrin Fruktóza Glukóza Laktóza Ribóza Sacharóza Škrob Slepý vz. Neznámý vz. Rozpustnost Thymol Molisch Nitrochrom Lugol Fehling Tollens Selivan Urea Bafoed Bial 18 Úloha č. 2: POLYSACHARIDY - ŠKROB A. STANOVENÍ ŠKROBU GRAVIMETRICKY Princip: Gravimetrie je založena na vyloučení stanovované složky ve formě málo rozpustné sloučeniny a na jejím převedení na sloučeninu o přesně definovaném složení, která se následně váží. Lze vážit i přímo izolovanou sloučeninu. Zkoušený vzorek se rozloží zásaditou hydrolýzou v prostředí KOH. Následně se škrobová zrna vysráží z roztoku vzorku. Pomůcky: Erlenmayerova baňka 250 ml (lx), nálevka, Biichenrova nálevka, odměrný válec 100 ml, kádinka 250 a 600 ml, váženka, pH papírky, mixer, vařič Vzorky: kuřecí párky „Striptýzky", paštika (nebo jiný masný výrobek) Chemikálie: 8% (w/v) roztok KOH v ethanolu, ethanol (96% a 50%) Pracovní postup: 1. Do vodní lázně (600 ml kádinka na magnetické míchačce) upevněte 100 ml Erlenmayerovu baňku. 2. Zvažte nejprve celou nožičku párku (staženého ze střívka) nebo balení paštiky. 3. Paštiku pouze jemně rozetřete, párek stáhněte ze střívka a rozemelte. 4. Do Erlenmayerovy baňky pak odvažte 2,5 - 3 g zhomogenizovaného vzorku 5. K masnému vzorku přilejte 80 ml 8% alkoholického roztoku KOH. 6. Vodní lázeň přiveďte k varu a obsah Erlenmayerovy baňky nechte za občasného míchání zahřívat na vodní lázni 45 min. 7. K plně rozpuštěnému vzorku přidejte 25 ml 50% horkého ethanolu. Dojde kvysrážení škrobových zrn, které nechte usadit na dno. 8. Opatrně odlijte horní vrstvu roztoku. 9. Usazený škrob 3x dekantujte 30 ml horkého 50% ethanolu. Účinnost dekantace sledujte pomocí pH papírku, kdy by hodnota pH měla poklesnout až k neutrální reakci. 10. Obsah Erlenmayerovy baňky přefiltrujte pomocí Biichnerovy nálevky s předem zváženým filtračním papírem. 11. Erlenmayerovu baňku důkladně vypláchněte horkým 50% ethanolem. 12. Sraženinu promyjte 20 ml chladného 96% ethanolu. Po dobu 10 minut nechte přes vzorek procházet vzduch. 13. Filtrační papír se vzorkem vložte do sušárny o teplotě cca 100 °C a sušte do konstantní hmotnosti. Výpočty: Vypočítejte obsah škrobu ve zkoumaném vzorku v hm %: m1 Wškrob =- * 100 kde mi = hmotnost získaného škrobu, mo = celková hmotnost vzorku, 19 Vyhodnocení a závěr: Jako výsledek uveďte celkový obsah škrobu v analyzovaných výrobcích (přepočtěte na hmotnost celé nožičky párku/balení paštiky) vyjádřený aritmetickým průměrem ze tří souběžných stanovení. Vzájemně srovnejte oba testované výrobky a pokuste se o srovnání s hodnotami deklarovanými výrobcem. Vzorek Navážka vzorku movg Obsah škrobu ve vzorku mi v g Celkový obsah škrobu v g Celkový obsah škrobu v % 20 B. DĚLENÍ ŠKROBU NA AMYLOSU A AMYLOPEKTIN Pomůcky: Plastová miska, kádinka 800 ml, odměrné válce 500 a 250 ml, nálevka, gáza, mixér, váhy, teploměr, skleněná tyčinka, indikátorový papírek, kapátko Vzorky: Bramborové hlízy 200 g Chemikálie: 0,9% (w/v) NaCl, 35% HC1, 0,0IM a 0,2M NaOH, Lugolův roztok Pracovní postup: 1. Zhomogenizujte v mixéru 200 g omytých a rozkrájených bramborových hlíz (na kaši) a převeďte do 800 ml kádinky naplněné 500 ml fyziologického roztoku. 2. Suspenzi během 5 minut 3x promíchejte, přefiltrujte na Biichnerově nálevce, odstraní se tak hrudky brambor. 3. Filtrát přelijte do dostatečně velké kádinky nechte usadit. 4. Kapalinu opatrně odlijte a usazený škrob 3x dekantujte 150 ml fyziologického roztoku, poté 150 ml 0,0IM NaOH a nakonec 3x 150 ml destilované vody. 5. Škrob nechejte vysušit na vzduchu do dalšího cvičení. 6. Zvažte a proveďte důkaz pomocí Lugolova roztoku. 7. Izolovaný škrob převeďte do Erlenmayerovy baňky, přidejte 1,5 ml 35% HC1 a postupným dokapáním 35% HC1 pomocí kapátka upravte pH na hodnotu 6-7. Kontrolu pH proveďte indikátorovým papírkem. 8. Vzorek nechte stát do dalšího cvičení, kdy se na dně kádinky objeví bílý gel (amylopektin). 9. Amylopektin dekantujte a pomalu odfiltrujte na Biichnerově nálevce. Vzorek amylopektinu sušte za laboratorní teploty do konstantní hmotnosti. Výpočty: Vypočet % obsahu škrobu/amylózy/amylopektinu ve vzorku: m w =- -100 ^■vzorek Vypočet obsahu amylózy a amylopektinu: ^■amylóza ~ Yľlškrob ~ ^■amylopektin Závěr: Jako výsledek uveďte procentuální výtěžek získaného škrobu z 200g bramborových hlíz, uveďte procentuální obsah amylózy a amylopektinu ve vzorku a jejich vzájemné zastoupení. škrob amylóza amylopektin g % 21 C. DŮKAZ PRÍTOMNOSTI ŠKROBU A SOLANINU V HLÍZÁCH BRAMBOR Princip: Důkaz škrobu: Principem Lugolovy reakce je vznik komplexu škrob-I3~ h(l) + l'(aq) ^ Ý-(aq) Ý~(aq) o- škrob I3~ komplex h(l) + T{aq) o- škrob I3~ komplex Důkaz solaninu: Reakcí kyseliny sírové s glykoalkaloidem solaninem (přítomný v naklíčených a zelených částech brambor) dochází ke vzniku červeného zbarvení. Dochází k narušení cyklopentanoperhydrofenanthrenového skeletu molekuly za vzniku specifického karbokationtu, který se projevuje červeným zbarvením Pomůcky: Petriho miska, 4 kapiláry, nůž, pinzeta, filtrační papír, podložní sklíčko, mikroskop Vzorky: bramborová hlíza naklíčená a nenaklíčená Chemikálie: Koncentrovaná H2SO4, koncentrovaná CH3COOH, 1% vodný roztok formaldehydu, 1% H2O2, Lugolův roztok (5 g I2 a 10 g KI v 85 ml destilované vody) Pracovní postup: 1. Z bramborové hlízy (lx naklíčené, lx nenaklíčené) ukrojte tenký plátek slupky (v případě naklíčené i s klíčkem) a položte jej na Petriho misku nebo podložní sklíčko. 2. Důkaz škrobu: na každý plátek kápněte 1-3 kapky Lugolova roztoku. 3. Důkaz solaninu: postupně kapejte na plátek 1-3 kapky kone. CH3COOH, kone. H2SO4, 1% roztoku formaldehydu a 1% H2O2. 4. Přítomnost solaninu se projeví načervenalým zbarvením, přítomnost škrobu se projeví temně modrým zbarvením. Závěr Jako výsledek uveďte porovnání naklíčené a nenaklíčené hlízy. Pokus monitorujte fotografiemi (postačí z mobilního telefonu). 22 D. ENZYMATICKÁ HYDROLÝZA ŠKROBU Princip: Škrob je složený z amylopektinu a a-amylózy, která vytváří šroubovíci na kterou se váže Lugolův roztok (modrofialové zbarvení). V případě, že k roztoku škrobu přidáme sliny, které obsahují a-amylasy, dojde ke štěpení a-glykosidické vazby, a tím k degradaci škrobu na menší jednotky (dextrin, maltóza). V tomto okamžiku Lugolův roztok nezbarví obsah zkumavky, jelikož se jód nemá kam vázat. O probíhajícím štěpení svědčí změna barvy produktu poskytovaného škrobems roztokem jódu. Během reakce přechází modré zbarvení škrobu s Lugolovým roztokem, přes hnědé (dextrin) až po slabě žluté (maltóza). Pomůcky: kádinka 250 ml, vařič, zkumavky, kapátko, odměrný válec, kapkovací destička Vzorky: Škrobový maz, lidské sliny (naředěné destilovanou vodou 1:1) Chemikálie: Lugolův roztok Pracovní postup: 1. Příprava škrobového mazu - rozmíchejte 1 lžičku škrobu v několika ml destilované vody a směs nalijte za stálého míchání do 200 cm3 vroucí vody. Maz nechte vychladnout. 2. Do 2 zkumavek nalijeme pomocí odměrného válce 5 ml škrobového mazu. Postup A: 3. První zkumavku nechejte jako referenční, do druhé zkumavky přidejte asi 5 ml lidských slin. 4. Obě zkumavky vložte do vodní lázně a mírně zahřívejte (asi 20 min). 5. Do každé zkumavky přikápněte 2-3 kapky Lugolova roztoku. 6. U referenčního vzorku (obsahuje pouze škrobový maz) by mělo dojít k modrému zbarvení. U druhé zkumavky (maz a sliny) dojde k vytvoření oraznžového zbarvení Postup B: 7. Do obou zkumavek přidejte asi 5 ml lidských slin. První zkumavku nechte ve stojánku jako referenční. Druhou zkumavku vložte do vodní lázně a mírně zahřívejte. 8. V pravidelných intervalech (5 min) odebírejte na kapkovací destičku vzorek zobou zkumavek, přidejte kapku Lugolova roztoku a sledujte změnu zbarvení. 9. Zabarvení referenčního vzorku bude modré na důkaz přítomnosti škrobu, u zabarvení zahřívaného vzorku by mělo docházet k barevným změnám v závislosti na rychlosti enzymatické degradace škrobu lidskými slinami. Závěr: Do protokolu uveďte barevnou změnu 23 Úloha č. 3: DŘEVO A POLYSACHARID CELULOSA A. STANOVENÍ ROZPUSTNOSTI CELULOS V HYDROXIDU SODNÉM Pomůcky: Erlenmayerova baňka 250 ml (2x), Petriho miska (2x), odměrný válec 100 ml, nálevka (3x), vařič, teploměr s rozsahem do 100°C, pH papírky, Zkušební vzorek: celulosa (bavlněný plášť, sisalový, jutový či konopný provaz, papírovina...) Chemikálie: 1% vodný roztok NaOH, 10% vodný roztok CH3COOH, Pracovní postup: 1. Na analytických vahách navažte 2,0 g celulosy a přendejte do Erlenmayerovy baňky. 2. Do baňky přidejte 100 ml 1% NaOH zahřátého na 60 °C a promíchejte. 3. Na baňku nasaďte nálevku a zahřívejte na vroucí vodní lázni v digestoři cca 1 h. Pravidelně obsah baňky v desetiminutových intervalech promíchávejte. 4. Obsah baňky zfiltrujte na Biichnerově nálevce přes předem zvážený filtrační papír. 5. Baňku promyjte 60 ml horké vody a vylijte na filtr. 6. Filtrační koláč promyjte 50 ml 10%CH3COOH a následně horkou vodou až do neutrální reakce filtrátu. Pomocí pH papírku ověřte pH filtrátu. 7. Filtrační koláč vyjměte z Biichnerovy nálevky, vložte do předem zvážené Petriho misky s víčkem a sušte nejméně 90 min do konstantní hmotnosti v sušárně vyhřáté na 103 °C ± 2 °C. Vyhodnocení a závěr: 1. Vypočítejte obsah (v %) nerozpustné celulózy ve vzorku dle vzorce: Wcel = — " 100 m0 kde w = obsah celulosy v %; mo = hmotnost celulosy v g; nu = hmotnost rozpuštěné celulosy vg. 2. Vypočítejte obsah nerozpustné celulózy přepočtený na absolutně suchou celulózu ze vzorce: obsah suché nerozpustné celulosy = obsah nerozpustné celulosy ■ / 100 f =- 100 — vlhkost celulosy (%) Obsah rozpustné celulózy vtažený na absolutně suchou celulózu lze pak stanovit přepočtem: ^rozp (s) — 100 — Cner0Zp (s) Jako výsledek uveďte obsah rozpustné a nerozpustné celulózy. Vzájemně porovnejte několik vzorků (filtrační papír, vatu, tampóny, patronu, plášť apod.) 24 B. STANOVENÍ VLHKOSTI DŘEVA Pomůcky: sušárna, analytické váhy, exsikátor, kádinky, Petriho misky (2x), lžička Zkušební vzorek: dřevěné piliny Postup práce: 1. Na analytických vahách zvažte suchou kádinku. Navažte do ní cca 1 g pilin. 2. Kádinku přikryjte Petriho miskou a dejte vysušit do sušárny při 105 °C po dobu 2h. 3. Kádinku i s víčkem nechte v exsikátoru vychladnout a kádinku s obsahem zvažte (na analytických vahách). 4. Tento postup dále opakujte v intervalu po lh, dokud se nebude hmotnost vzorku pohybovat v rozmezí 0,2 mg. Vyhodnocení a závěr: Vlhkost ve vzorku dřeva vypočítejte ze vzorce: kde v = vlhkost dřeva v %, A = hmotnost prázdné kádinky v g, B = hmotnost kádinky se vzorkem před vysušením v g, C = hmotnost kádinky se vzorkem po vysušení v g Obsah vlhkosti dřeva vyjádřete aritmetickým průměrem ze dvou souběžných stanovení. 25 C. PŘÍPRAVA NITRÁTU CELULOSY Pomůcky: Erlenmayerova baňka 250 ml, Zkušební vzorky: Vata, celulosa Chemikálie: HNO3, H2SO4, ethanol, kafr, aceton Pracovní postup: 1. V Erlenmayerově baňce v digestoři opatrně připravte nitrační směs smícháním 12 ml HNO3 s 20 ml H2SO4. 2. Nitrační směs ochlaďte v ledové vodní lázni na teplotu 20 °C. 3. Asi 1 g vaty (celulózy) vhoďte do nitrační směsi, baňku uzavřete plastovou zátkou a asi 5 minut promíchávejte. 4. Vatu opatrně vyjměte z nitrační směsi do kádinky s vodou, kde ji pořádně properte (vodu alespoň 2x vyměňte). 5. Vypranou nitrovanou vatu vysušte mezi filtračními papíry a dosušte v mírně zapnuté sušárně (případně ponechte vyschnout do dalšího cvičení). 6. Nitrovanou celulózu rozdělte na 4 části. 7. Porovnejte rozpustnost nitrocelulózy a celulózy v acetonu. 8. Porovnejte rozpustnost nitrocelulózy a celulózy v ethanolu. 9. Odeberte 0,5 g nitrocelulózy. Ve zkumavce rozpusťte 0,1 g kafru v 8 ml acetonu. Do připraveného roztoku vhoďte 0,5 g nitrocelulózy ovlhčeného ethanolem. Zkumavku uzavřete a důkladně promíchejte. 10. Viskózni roztok nalijte na Petriho misku, uložte do digestoře a nechte do dalšího cvičení vyschnout. Na Petriho misce vznikne průsvitný film z celuloidu. 11. Čtvrtý (zbylý) kousek vaty jen opatrně položte na žíhací síťku (odvážní na rozevřenou dlaň) a zapalte. Závěr: Porovnejte rozpustnost celulózy a nitrocelulózy, zapište proces nitrace celulózy chemickou rovnicí (včetně přípravy nitrační směsi). 26 D. SIMULACE VÝROBY PERGAMENOVÉHO PAPÍRU Pomůcky: kádinky 600 ml (2x), pinzeta, filtrační papír Chemikálie: 96% H2SO4, NH3 Pracovní postup: 1. Ve skleněné vaně (velké kádince) opatrně smíchejte 30 ml 96%H2S04 s 15 ml ledové destilované vody. Roztok chlaďte v ledové lázni na cca 5 °C. 2. Z filtračního papíru vystřihněte několik stejně velkých dílů. 3. První díl papíru ponořte pomocí pinzety do chladného roztoku H2SO4 a ihned po vyjmutí jej vložte do kádinky s destilovanou vodou s 10 kapkami NH3. 4. Papír nechte alespoň 5 min propírat a poté nechte usušit na hladkém povrchu. 5. Postup 3. a 4. opakujte - vzorek papíru nechte v kyselině různě dlouho Závěr: Srovnejte vlastnosti papíru ponořeného a neponoreného do H2SO4 (mechanickou pevnost, pružnost, smáčivost). 27 E. STANOVENÍ VLHKOSTI CELULOSY Pomůcky: sušárna, analytické váhy, exsikátor, váženka (2x), lžička Zkušební vzorek: celulóza (bavlna sepraná, sisalový, jutový či konopný provaz ...) Pracovní postup: 1. Na analytických vahách zvažte prázdnou váženku a váženku s asi 1 g celulózy. 2. Váženku s celulózou vložte do vyšší kádinky a kádinku umístěte do sušárny vyhřáté na teplotu 103 °C po dobu nejméně 2 hodin. 3. Váženku vyjměte ze sušárny a vložte do exsikátoru, kde ji ponechte vychladnout na laboratorní teplotu. 4. Váženku se vzorkem zvažte na analytických vahách a opět umístěte do kádinky v sušárně. 5. Celý postup od bodu 2 opakujte do doby, než bude mít vysušený vzorek konstantní hmotnost v rozmezí 0,2 mg. Vyhodnocení a závěr: Vlhkost celulózy se vypočte podle vzorce: kde v = vlhkost celulózy v % A = hmotnost prázdné váženky v g, B = hmotnost váženky se vzorkem celulózy před vysušením v g C = hmotnost váženky se vzorkem celulózy po vysušení v g Obsah vlhkosti celulózy vyjádřete aritmetickým průměrem ze dvou souběžných stanovení. 28 F. STANOVENÍ LIGNINU VE DŘEVĚ (metoda podle Komárova) Pomůcky: váženka, odměrný válec 25 ml a 250 ml, frita (2x), varná baňka 500 ml (2x), topné hnízdo 500 (2x), zpětný chladič (2x), vařič, hodinové sklo Zkušební vzorek: dřevěné piliny vysušené při 105 °C (z předešlé úlohy) Chemikálie: 72% vodný roztok H2S04, Pracovní postup: 1. Na analytických vahách navažte 1 g suchých dřevěných pilin a kvantitativně převeďte do kádinky 2. Přidejte 15 ml 72% H2SO4, přikryjte hodinovým sklem a na 2 hodiny umístěte na vodní lázeň vytemperovanou na 25 °C. 3. Vzorek pravidelně promíchávejte tyčinkou 4. Poté směs opatrně přelijte do 500 ml varné baňky se 150 ml vody a vařte pod zpětným chladičem 1 hodinu. 5. Lignin ve formě tmavohnědého prášku nechte usadit na dně baňky a filtrujte přes předem zváženou fritu. Filtrační koláč promyjte 50 ml horké vody. 6. Fritu s izolovaným ligninem sušte v sušárně při teplotě 105 °C do konstantní hmotnosti Výpočet: Obsah ligninu ve dřevě lze stanovit dle vzorce: fflT L = — • 100 m kde L = obsah ligninu ve dřevě v %, fflL = hmotnost ligninu na filtračním kelímku v g, m = navážka vzorku dřevěných pilin v g. Závěr: Uveďte vypočtený obsah ligninu ve vzorku. Na základě tabulky v teoretické části odhadněte, zda piliny pocházely z listnatého či jehličnatého stromu. 29 G. STANOVENÍ a CELULOSY (metodou dle Klauditze) Princip: CeHioOs + 4K2Cr207 + 16H2S04 -> 6 C02 + 6 K2S04 + 4 Cr2(S04)3 + 21 H20 Pomůcky: Erlenmayerova baňka 100 ml (4x), odměrný válec 5 ml, 10 ml (2x), 50 ml, 100 ml, lžička, odměrná baňka 100 ml (4x), pipeta 5 ml, 20 ml, frita SI (2x), vařič, nálevka střední (2x). Chemikálie: 96% H2S04 p.a., 17,5% vodný roztok NaOH, 0,2 M vodný roztok Na2S203, 5% vodný roztok KI, 1 M vodný roztok K2Cr207 - pozor toxická látka!! Pracovní postup: 1. Na analytických vahách navažte 3,0 g celulosy. 2. Celulosu přeneste do 75 ml Erlenmayerovy baňky 3. Přidejte 40 ml 17,5% NaOH o teplotě 20 ± 0,2 °C 4. Intensivně třepejte v ruce až se obsah baňky rozvlákní a zhomogenizuje (cca 10 minut). 5. Nechte stát 15 minut při teplotě 20 °C, poté řádně ručně protřepte (cca 1 minutu) a nechte stát dalších 15 minut při teplotě 20 °C. Důkladně promíchejte lžičkou (1 minutu) a filtrujeme přes filtrační kelímek za odsávání. 6. Filtrační koláč promyjte 50 ml vody o teplotě 20 °C. 7. Filtrační roztok s promývací vodou nalijte do odměrné baňky (100 ml) a doplňte destilovanou vodou. 8. Odpipetujte 1 ml filtrátu do 50 ml Erlenmayerovy baňky, přidejte 2 ml 1 M K2Cr207 a 2 ml H2S04. 9. Povařte 1 minutu (varný kamínek!). 10. Erlenmayerovu baňku ochlaďte pod tekoucí vodou. 11. Obsah baňky přelijte do 25 ml odměrné baňky, doplňte destilovanou vodou po rysku, promíchejte. 12. Do titrační baňky napipetujte 25 ml roztoku, přidejte 100 ml vody a 10 ml 5% KI. Ve tmě nechte stát 5 min. 13. Titrujte 0,1 M Na2S203 do žlutého zabarvení roztoku, poté přidejte 5 ml škrobového mazu a dotitrujte do modrého (až černého) zabarvení. Vyhodnocení: Obsah a-celulosy {aCnauditz) v % se vypočte ze vztahu: a^Klauditz = 100 — RS RS je zjištěné procento rozpuštěné celulózy. RS = V> °-°00675 N z 100 n2 kde je Vi = spotřeba 0,1 M Na2S203 při titraci v ml, ri2 = navážka celulózy na stanovení v g, z = zředění (100), M= molarita roztoku Na2S203, 0,000675... přepočítávací faktor na celulózu Závěr: Obsah a-celulosy vyjádřete jako aritmetický průměr ze tří titraci. 30 H. STANOVENÍ PODÍLU HOLOCELULOSY VE DŘEVĚ (metoda podle Wise) Pomůcky: Erlenmayerova baňka 250 ml (2x), nálevka, vodní lázeň, magnetická míchačka (2x), váženka (2x), vodní lázeň, odměrný válec 25, 50, 250 ml, vařič, Petriho miska (2x), Zkušební materiál: Dřevěné piliny Chemikálie: ledová CH3COOH, NaC104 Pracovní postup: 1. Na analytických vahách navažte 1,5 g dřevěných pilin a kvantitativně přeneste do Erlenmayerovy baňky 2. K pilinám přidejte magnetické míchadlo, 160 ml vroucí vody, 2,5 ml ledové kyseliny octové a2,5gNaC104 3. Baňku vložte do vroucí vodní lázně (kotlík) a za stálého míchání zahřívejte 40 minut. 4. Po 40 min znovu přidejte 2,5 ml ledové CH3COOH a 2,5 g NaC104 a zahřívejte dalších 40 min 5. Po dalších 40 min. ještě jednou přidejte 2,5 ml ledové kyseliny octové a 2,5 g NaC104 a zahřívejte dalších 40 min 6. Po ukončení delignifikace baňku ochlaďte proudem tekoucí studené vody 7. Směs filtrujte přes předem zvážený filtrační papír (analytické váhy) na Biichnerově nálevce. 8. Filtrační koláč promyjte 2x 50 ml studené vody a pak 20 ml acetonu 9. Filtrační koláč izolované holocelulózy sušte na Petriho misce v sušárně vyhřáté na 105 °C do konstantní hmotnosti. Vyhodnocení a závěr: Stanovte obsah holocelulózy ve dřevě dle vztahu: V H = - ■ 100 n HS = H ■/(%) 100 f = - ; 100-v kde je H = obsah holocelulózy ve dřevě v % Hs = obsah holocelulózy ve dřevě v % přepočtený na sušinu dřeva V= hmotnost vláknitého materiálu (holocelulózy) na filtračním kelímku v g n = navážka vzorku dřeva v g /= přepočítávací faktor na sušinu v = vlhkost dřeva v % Jako výsledek uveďte obsah holocelulózy ve dřevě a v sušině dřeva. 31 L STANOVENÍ a CELULOSY (metodou dle Tappiho) Pomůcky: kádinka 250 ml (2x), odměrný válec 10 ml, 50 ml (2x), hodinové sklíčko, filtrační kelímek SI (2x), kádinka 400 ml, nálevka střední (2x), Zkušební vzorek: Celulosa čistá, filtrační papír Chemikálie: 10% vodný roztok CH3COOH, 17,5% vodný roztok NaOH, Pracovní postup: 1. Do 250 ml kádinky navažte na analytických vahách cca 3 g celulózy. 2. K celulóze přilijte 35 ml 17,5% NaOH o teplotě 20 ± 0,2 °C a nechte 3 minuty stát 3. Poté za pomocí skleněné tyčinky 3 minuty míchejte a rozvlákňujte. 4. Po 3 minutách přilejte dalších 10 ml 17,5% NaOH a rozvlákňujte 2,5 minuty. 5. Opět přidejte 10 ml 17,5% NaOH a rozvlákňujte 3 minuty. 6. Dále přilejte 10 ml 17,5 % NaOH a rozvlákňujeme již jen 1 minutu. 7. Kádinku přikryjte hodinovým sklíčkem a nechte stát 25 minut. 8. Přidejte 25 ml vody o teplotě 20 °C a dobře promíchejte lžičkou (cca 1 minutu) 9. Rozvlákněnou celulózu filtrujte přes předem zváženou a vysušenou fritu. 10. Filtrační zbytek promyjte 300 ml vody o teplotě 20 ± 0,2° C za stálého odsávání. 11. Odsávání přerušte a na filtrační zbytek nalijte 40 ml 10% CH3COOH o teplotě 20 ± 0,2 °C a nechte 5 minut reagovat. 12. Kyselinu odsajte a zbytek na fritě opět promyjte 300 ml vody o teplotě 20 °C. 13. Kelímek se zbytkem sušte v sušárně při teplotě 103 ± 2 °C do konstantní hmotnosti. 14. Po vychladnutí v exsikátoru zvažte. Vyhodnocení a závěr: Stanovte obsah a-celulózy {oCtappi) v [%] dle vzorce: kde je mi = hmotnost a celulózy po vysušení v g, ni = navážka celulózy na stanovení v g. Závěr: Obsah a-celulosy vyjádřete jako aritmetický průměr ze tří měření. 32 TUKY, OLEJE, VOSKY Kapitola „Tuky, oleje a vosky" je do cvičení zařazena proto, že tyto materiály hrají významnou úlohu v oblasti chemie restaurování a konzervování, podléhají vlivu kyslíku, teploty a UV záření, což katalyzuje polymerační proces, tzv. vysychání. Tuky (lipidy) jsou estery vyšších mastných karboxylových kyselin a trojsytného alkoholu (glycerolu). Nej častějšími mastnými kyselinami v molekule tuku jsou kyselina olejová, linolová, palmitová, stearová a myristová. Podle skupenství rozlišujeme pevné tuky, u nichž převažují zejména nasycené mastné kyseliny, a oleje, jejichž skupenství je kapalné a které obsahují větší množství nenasycených mastných kyselin. Dalším základním dělením je dělení na tuky rostlinné a tuky živočišné. Vlivem vlhkosti a katalytické reakce (enzym lipáza) dochází k zmýdelňování tuků. Oxidací vícenásobně nenasycených mastných kyselin a jejich následnou polymerací dochází ke vzniku tvrdého filmu, tzv. vysychání olejů. Dvojné vazby nenasycených mastných kyselin mohou podléhat hydrogenační reakci, tzv. ztužování. Jako oleje bývají označovány kapalné tuky. Oleje se nerozpouštějí ve vodě a mají menší hustotu než voda. Potravinářské, jedlé oleje jsou rostlinné kapalné triacylglyceroly. Mohou mít jednu nebo více nenasycených vazeb. Čím více je v řetězci násobných vazeb, tím je olej tekutější. Technické oleje jsou nejčastěji založeny na použití minerálních olejů, tedy směsí uhlovodíků z ropy či silikonových olejů. Vosky jsou estery vyšších mastných kyselin, nejčastěji kyseliny palmitová, stearová, laurová a myristová, a vyšších jednosytných alkoholů. Přirozeně se vyskytují v přírodě jak u rostlin, tak u živočichů. Vosky jsou odolné vůči hydrolýze a nepodléhají enzymatickému rozkladu. Vosky přírodního původu kromě výše zmíněných látek obsahují spoustu příměsí dalších látek (volné karboxylové kyseliny, alkoholy, steroly atd.). Vosky jsou tuhé, ve vodě nerozpustné látky odolné vůči oxidaci a hydrolýze. Mezi nejznámnější vosky patří včelí vosk, lanolín, vorvaňovina, karnaubský vosk atd. CH2-0- C-R, I ° CH-O- C-R2, í ľ I ° CH2-0- C-R3 II O Obrázek 2: Obecný vzorec olejů a tuků 33 Úloha č. 4: TUKOVÉ CHARAKTERISTIKY A. PEROXIDOVÉ ČÍSLO Vlivem oxidace (žluknutí) dochází ke vzniku hydroperoxidů. Peroxidové číslo je ukazatelem obsahu primárních produktů oxidace tuků. Slouží k posouzení stupně žluknutí tuků, které je způsobeno autooxidací tuků vzdušným O2. Hodnota poskytuje informaci o počáteční fázi žluknutí ještě před senzorickými změnami způsobenými sekundárními produkty. Princip: Principem je titrační stanovení I2, vyloučeného při oxidaci I~ přítomnými peroxidy odměrným roztokem thiosíranu sodného. ROOH + 2KI + 2CH3COOH -> ROH + h + 2CH3COOK + H20 I2 + 2Na2S203 -> 2NaI + Na2S406 Vyjadřuje se v \xg aktivního kyslíku na 1 g tuku. Přístroje a pomůcky: 250 ml Erlenmayerova baňka (4x), Chemikálie a roztoky: Chloroform, CH3COOH, čerstvě připravený 10% vodný roztok KI, indikátor škrobový maz, 0,01 mol.r1Na2S203 Použitý vzorek: máslo, margarin, pokrmový tuk, sádlo, olej... Pracovní postup: Stanovení se provede 3 x u stejného vzorku. 1. Příprava organického rozpouštědla - do uzavíratelné baňky připravte 100 ml směsi chlorofornrCPbCOOH v poměru 2:3 2. Do Erlenmayerovy baňky navažte 2 g vzorku s přesností 0,01 g. 3. Přilejte 25 ml směsi chloroform - CH3COOH. 4. Kapalné vzorky pouze promíchejte, pevné vzorky mírně zahřívejte na vařiči, až dojde k rozpuštění vzorku. 5. Přidejte 5 ml roztoku KI, baňku zazátkujte, mírně promíchejte a uložte na tmavé místo na 20 minut. 6. Přidejte 50 ml destilované vody a promíchejte. 7. Přidejte 5 ml škrobového mazu a promíchejte. 8. Obsah baňky titrujte odměrným roztokem 0,01 moll-1 Na2S203 do odbarvení vrchní (vodné) vrstvy (čirá). Spodní vrstva by měla být pouze nažloutlá. 9. Pokud je spodní vrstva fialová, baňka se uzavře a v tukové vrstvě přítomný jód se protřepáním uvolní do vodné vrstvy. Tato vrstva se poté ještě podle potřeby titruje do trvalého odbarvení. 10. Slepý pokus. Proveďte stejným způsobem jako stanovení vzorku s tím, že se vynechá zkušební vzorek. Směs se nezahřívá, po přidání KI se pouze uloží do tmy. Titrujte do úplného odbarvení Vyhodnocení: Peroxidové číslo (Čp) vyjádřené v jug kyslíku na 1 g tuku se vypočte podle vztahu: 34 kde je cNa2s2o3 = koncentrace odměrného roztoku NaiSiCb v mol.l^s VNa2s2o3 = spotřeba odměrného roztoku NaiSiCb na vlastní stanovení v ml, VQ = spotřeba odm. roztoku NaiSiCh na slepý pokus v ml, mv = navážka zkušebního vzorku v g. Závěr: Peroxidové číslo se vyjádří aritmetickým průměrem ze tří souběžných stanovení. Do protokolu uveďte také popis použitého vzorku na stanovení. Poznámka: Maximální přípustná hodnota Čp tuku j e 10 pimol (l/2ROOH)/g; tuk vysoké j akosti < 2; zcela čerstvý tuk < 0,5. 35 B. JODOVÉ ČÍSLO - Hanušova metoda Jodové číslo je měřítkem nenasycenosti tuku (oleje), tedy obsahu dvojných vazeb. Určuje procentuální zastoupení nenasycených mastných kyselin. Je definováno jako množství halogenu přepočítaného na jod, které se váže na vzorek. Slouží k posouzení čistoty tuku, k identifikaci známých tuků a k posouzení použitelnosti tuku pro různé účely. Metoda je vhodná ke stanovení nenasycených běžných tuků. Není vhodná ke stanovení nenasycenosti oxidovaných a polymerovaných tuků. Tuky s vyšší hodnotou jodového čísla jsou tekutější. Jodové číslo je také ukazatelem žluknutí. Čím je nižší hodnota Čj, tím je tuk čerstvější. Tuk Cj% Tuk Cj% Máslo 26-40 Slunečnicový olej 127-136 Lůj 40-48 Lněný olej 170-204 Sádlo 53-77 Olivový olej 75-94 Ricinový olej 81-90 Kokosový olej 6,3-10,6 Podzemnicový olej 84-100 Olejová kys. 89,9 Řepkový olej 94-106 Linolová kys. 181,0 Sójový olej 114-138 Linolenová kys. 273,5 Princip: Halogeny se adují na dvojné vazby nenasycených mastných kyselin. Reakce probíhá v chloroformu, který působí jako tukové rozpouštědlo, a v CH3COOH, která dodává prostředí nezbytnou polaritu. Po reakci halogenů s tukem, se přidáním KI nezreagovaný Brl převede na I2. Nespotřebované množství halogenidu se stanovuje titrací Na2S203 za použití škrobového mazu. -CH=CH- + IBr -> -CHBr-CHI- IBr + 2KI -> KI + KBr + I2 I2 + 2Na2S203 -> 2NaI + Na2S406 Udává se jako množství halogenu vyjádřeného jako hmotnost I2 v g, které se může adovat na 100 g tuku Přístroje a pomůcky: Erlenmayerova baňka 250 ml se zátkou (4x) Chemikálie a roztoky: Chloroform, zásobní roztoky: 0,1 moll-1 jódmonobromidu IBr (Hanušovo činidlo), 10% roztok KI, indikátor škrobový maz, 0,1 moll-1 Na2S203 Vzorek: máslo, margarin, pokrmový tuk, sádlo, olej,... Pracovní postup: Stanovení proveďte 3 x u stejného vzorku. 1. Do Erlenmayerovy baňky navažte gig zkušebního vzorku s přesností na 0,01. 2. Přidejte 10-15 ml chloroformu a nechte rozpustit. Rozpouštění pevného vzorku lze urychlit mírným zahřátí m. 3. Přidejte 25 ml Hanušova činidla (IBr), baňku uzavřete, obsahem promíchejte a baňku uložte do tmy na 30-60 minut. 4. Opláchněte zátku do baňky. 36 5. Přidejte 20 ml 10% KI a 100 ml destilované vody. 6. Obsah baňky titrujte za stálého míchání 0,1 moll-1 odměrným roztokem Na2S203 do oranžového (oranžovo-žlutého) zabarvení. 7. Přidáme 3 ml škrobového mazu a titrujte až do odbarvení vodné fáze. 8. Je-li spodní chloroformová fáze fialová, protřepte a dotitrujte. Spodní vrstva má být nažloutle až hnědě zbarvena rozpuštěným tukem Slepý pokus: Proveďte stejným způsobem jako u vzorku s tím, že se vynechá zkušební vzorek. Vyhodnocení: Jodové číslo (Čj) je dáno vztahem: £ _ (Yo VNa2s2q3) • cNa2s2q3 ' m 1 ~ m„ ■ 10 9 L100#J Kde: Cwa2s2o3 = koncentrace odměrného roztoku Na2S203 v mol.ľ^s VNa2s2o3 = spotřeba odměrného roztoku Na2S203 na vlastní stanovení v ml, VQ = spotřeba odm. roztoku Na2S203 na slepý pokus v ml, M= molární hmotnost jódu mv = navážka zkušebního vzorku v g. Závěr: Jodové číslo se vyjádří aritmetickým průměrem ze 3 souběžných stanovení. Do protokolu se také uvede popis použitého vzorku na stanovení. 37 C. ČÍSLO KYSELOSTI Číslo kyselosti Čk udává obsah volných mastných kyselin v tuku. Uvolněné mastné kyseliny se hromadí a zvyšují tak Čk. Kvalita tuků a olejů s rostoucí hodnotou čísla kyselosti klesá. Poskytuje tedy informaci o množství volných kyselin ve vzorku, které mohou mimo jiné vznikat při skladování jako produkt hydrolýzy tuků v důsledku lipolytické aktivity. Hodnoty čísla kyselosti nebývají vysoké. Tuk C k mg/g Sádlo 1,3 Olivový olej papenský 6,6 Rostlinné oleje raf. 0,6 Rostlinné oleje panenské 4,0 Margarín 2,0 Princip: Metoda je založena na principu neutralizace volných karboxylových skupin mastných kyselin hydroxidem. RCOOH + KOH -> RCOOK + H20 Pomůcky: vařič, Erlenmayerova baňka (2x), Chemikálie: 96% ethanol, 1% ethanolický roztok fenolftaleinu, 0,01 mol l"1 roztok KOH v 96% EtOH, Vzorek: sádlo, rostlinný olej, máslo, ... Pracovní postup: Stanovení proveďte 3x u stejného vzorku. 1. Na analytických vahách odvažte 2 g vzorku s přesností 0,01 g a kvantitativně převeďte do 250 ml Erlenmayerovy baňky. 2. Ke vzorku přidejte 50 ml ethanolu a 5 kapek 1% fenolftaleinu. 3. Obsah baňky zahřívejte k varu (varný kamínek!!) a ihned titrujte 0,01 moll-1 KOH do stálého slabě růžového zbarvení Slepý pokus: Proveďte stejným způsobem jako u vzorku s tím, že se vynechá zkušební vzorek Vyhodnocení a závěr: 38 Číslo kyselosti (Č£) lze stanovit jako hmotnost KOH (v mg) potřebného k neutralizaci 1 g vzorku. M (Vkoh ^o) 1 ckoh [mg-g x] m. v Kde: cK0H = koncentrace odměrného roztoku KOH v mol.l^s VK0H = spotřeba odměrného roztoku KOH na vlastní stanovení v ml, VQ = spotřeba odm. roztoku KOH na slepý pokus v ml, M= molární hmotnost KOH mv = navážka zkušebního vzorku v g. Kyselost tuku lze vyjádřit stupněm kyselosti (SK), který udává spotřebu roztoku KOH v ml k neutralizaci volných kyselin ve 100 g tuku. Mezi SK a ČK platí tento vztah: Jako výsledek uveďte číslo kyselosti a stupeň kyselosti jako aritmetický průměr jednotlivých stanovení. SK 100 ČK 56,11 1,7825 ČK 39 D. ČÍSLO ZMÝDELNĚNÍ Číslo zmýdelnění vyjadřuje množství všech mastných kyselin ve vzorku (esterově vázaných i volných). Velikost Čz roste se stoupajícím množstvím volných i vázaných mastných kyselin. Zmýdelnění (saponifikace) je proces kdy dochází k rozkladu esterů tuků na příslušný alkohol a volné mastné kyseliny v alkalickém prostředí. Tuk C Tuk C Sádlo 192-203 Slunečnicový olej 188-194 Palmový olej 190-209 Lněný olej 189 Podzemnicový olej 187-196 Olivový olej 184-196 Řepkový olej 168-193 Kokosový olej 248-265 Sójový olej 189-195 Princip: Stanovení se provádí zpětnou acidimetrickou titrací. Vzorek se nejdříve zmýdelní varem s nadbytkem alkoholického roztoku KOH. Nezreagovaný K OH je stanoven titrací HC1 na indikátor fenolftalein KOH + HC1 -> KC1 + H20 Přístroje a pomůcky: Topné hnízdo, kulatá baňka (3x), zpětný chladič (2x), pipeta 25 ml, Chemikálie a roztoky: 0,5 mol-r1 ethanolický roztok KOH, 0,5 moH-1 HC1, 1 % roztok fenolftaleinu Vzorek: sádlo, olej, pokrmový tuk,... Pracovní postup: Stanovení se provede 3x u stejného vzorku. 1. Do kulaté baňky navažte 3 g zkušebního vzorku s přesností na 0,01 g. 2. Pipetou přidejte 25,0 ml roztoku KOH a několik varných kamínků. 3. Na baňku připojte zpětný chladič a zmýdelňujte (vařte) 30 min. 4. Po zmýdelnění musí být obsah baňky čirý. 5. K horkému roztoku přidejte cca 5 kapek indikátoru fenolftalein a ihned titrujte 0,5 moH"1 HC1 do vymizení růžového (červeného) zabarvení. Slepý pokus: Proveďte stejným způsobem jako u vzorku s tím, že se vynechá zkušební vzorek. Směs se nevaří, pouze zahřeje k varu a následně titruje. 40 Vyhodnocení: Číslo zmýdelnění (Čz) v mg KOH na 1 g vzorku se vypočte podle vztahu: čz fc-Fj c f 56,1 Kde: Vo = spotřeba odměrného roztoku HC1 (c = 0,5 mol.ľ1) na slepý pokus v ml, Vi = spotřeba odměrného roztoku HC1 (c = 0,5 mol.ľ1) na vlastní stanovení v ml, c = koncentrace odměrného roztoku HC1 v mol.ľ1, /= faktor odměrného roztoku HC1, m hmotnost zkušebního vzorku v g. Vyjadřuje se jako množství KOH v mg, potřebné k neutralizaci volných mastných kyselin a k hydrolýze (zmýdelnění) esterů obsažených v 1 g látky. Závěr: Číslo zmýdelnění se vyjádří aritmetickým průměrem ze dvou stanovení. Do protokolu se také uvede popis použitého vzorku na stanovení. E. ČÍSLO ESTEROVÉ Esterové číslo Če je hmotnost KOH v mg potřebná k neutralizaci esterově vázaných kyselin v 1 g tuku. Vyjadřuje obsah esterově vázaných kyselin Vyhodnocení: Če se vypočte z rozdílu čísla zmýdelnění a čísla kyselosti: ČE = ČZ-ČK Vynásobením Če faktorem 0,547 se vypočte obsah volného glycerolu v tuku (mg/g). Závěr: Do protokolu uveďte výpočet obsah esterově vázaných kyselin a obsah volného glycerolu ve vybraném vzorku. 41 BÍLKOVINY A AMINOKYSELINY Bílkoviny, odborně proteiny, jsou základem všech známých organismů, kde plní funkce stavební (kolagen, keratin, elastin), transportní (hemoglobin), katalytické (enzymy, hormony), ochranné a obranné (imunoglobin, fibrín, fibrinogen), pohybové (aktin, myosin). Základní stavební částicí bílkovin jsou aminokyseliny. Některé aminokyseliny je schopné tělo vyrábět samo, jiné musí přijímat v potravě (tzv. esenciální aminokyseliny). V bílkovinách jsou aminokyseliny vzájemně vázány aminoskupinami -NH2 a karboxylovými skupinami -COOH amidovou vazbou -NH-CO-, která se nazývá peptidová vazba. Rozlišujeme primární, sekundární, terciární a u některých složitějších proteinů ještě kvartérní strukturu bílkovinových řetězců. Primární struktura - pořadí aminokyselin v řetězci proteinu označujeme jako primární strukturu. Primární struktura udává chemické vlastnosti bílkoviny. Sekundární struktura - je geometrické uspořádání polypeptidového řetězce mezi několika po sobě jdoucími aminokyselinami. Primární struktury j sou uspořádány do tzv. alfa šroubovice (a-helix), skládaného listu (P-sheet), neuspořádaných struktura (random coil). Terciární struktura - pojmem se označuje trojrozměrné uspořádání celého peptidového řetězce. Je tvořena střídáním sekundárních struktur. Podle tvaru a vlastností rozlišujeme strukturu ve vodě rozpustnou globulární s tvarem klubka a fibrilární (myosin) vláknitou ve vodě nerozpustnou. Celá struktura je stabilizována kovalentními vazbami. Kvartérní struktura - řeší prostorové uspořádání bílkovin. Takovéto uspořádání vykazují jen složitější komplexy bílkovin. Obrázek 3: struktura bílkovin - A) primární; B) sekundární; C) terciární; D) kvartérní 42 Úloha č. 5: DŮKAZ BÍLKOVIN A AMINOKYSELIN A. BIURETOVÁ REAKCE - důkaz bílkovin Princip Biuretová reakce je reakce, při níž se dokazuje bílkovina pomocí směsi roztoků hydroxidu sodného NaOH a síranu meďnatého CuSCm. Bílkovina se při důkazu zbarví modrofialové. Biuretovou reakcí dokazujeme peptidové -NH-CO- vazby, kterými se aminokyseliny vzájemně vážou. V alkalickém prostředí dochází k reakci mezi Cu2+ a peptidovou vazbou za vzniku komplexu Cu2+ a bílkoviny. Vzniká charakteristický barevný - fialový komplex - biuret H2N-CO-NH-CO-NH2. R R I I 0=C C^O NH NH R — HC^ \ ^CH — R CÚ L / \ J> //^ 1 i R R Vzorek Vaječný bílek, mléko, jogurt,... Pomůcky Zkumavky, stojan na zkumavky Chemikálie 0,05 moll"1 CuSCm ■ 5H20 (Fehlingovo činidlo I), Postup 1. Vaječný bílek zřeďte vodou v poměru 1 : 2 (bílek : voda) a důkladně promíchejte. Hrudky můžete odstranit přefiltrováím přes smotek vaty v nálevce. Na Petriho misku nebo do zkumavky dejte další druhy vzorků. 2. K 1 ml bílkového filtrátu či jiného vzorku ve zkumavce nebo Petriho misce přidejte 1 ml CuS04 ■ 5H20 a 1 ml 3. Pozorujte vznik modrofialové zbarvení - biuretovou reakci. Závěr: 4. Do protokolu uveďte pozorování. 43 B. XANTOPROTEINOVÁ REAKCE Princip Principem xantoproteinové reakce je nitrace aromatických částí aminokyselin, např. tyrosin, tryptofan. K nitraci postačuje např. HNO3. Pozitivní reakce se projeví vznikem žlutého zbarvení, které je způsobeno vznikajícími nitrosloučeninami o o Pozitivní reakci poskytuje i kolagen, ačkoli nemá aromatické aminokyseliny. Pomůcky: Zkumavky, držák na zkumavky, kahan Chemikálie: HNO3 koncentrovaná, 20% NaOH nebo kuličky NaOH Vzorek: vaječný bílek, mléko, jogurt,... Pracovní postup: 1. Vaječný bílek zřeďte vodou v poměru 1 : 2 (bílek : voda), důkladně promíchejte a filtrujte přes smotek vaty v nálevce. Na Petriho misku nebo do zkumavky dejte další druhy vzorků. 2. Pracujte v digestoři. 3. Ke 2 ml bílkového filtrátu či jiného vzorku přidejte 1 ml HNO3. Vzniká žlutá sraženina. 4. Ke sraženině opatrně přidejte několik zrnek NaOH, kdy nejprve dochází k neutralizační reakci mezi HNO3 a NaOH. Opatrně protřepte, může dojít k bouřlivé reakci. 5. Při nadbytku NaOH pozorujte vznik oranžového xantoproteinu. Závěr: Do protokolu uveďte pozorování. 44 C. NINHIDRINOVÁ REAKCE Princip: 45 D. DŮKAZ SÍRNYCH AMINOKYSELIN Princip Sirné aminokyseliny (cystein, methionin) působením zásad uvolňují za tepla sulfan H2S. sulfan lze dokázat pomocí octanu olovnatého či jiné rozpustné olovnaté soli za vzniku černého sulfidu olovnatého. CHr-CH-COOH P I SH NH-, cystein CHrCřtrC H-cooH I - " I S-CH3 NH, methionin Pomůcky: Zkumavky, stojan na zkumavky, držák na zkumavky, kahan Chemikálie: Zředěný (CH3COO)2Pb, zředěný NaOH, Vzorek: Roztok vaječného bílku Pracovní postup: 1. Do zkumavky nalijte 2 ml (CH3COO)2Pb. 2. Přidávejte roztok NaOH až do rozpuštění sraženiny. 3. Následně přidejte 2 ml roztoku vaječného bílku a obsah zkumavky promíchejte. 4. Zkumavku zahřejte nad kahanem 5. Sledujte vývoj černé sraženiny sulfidu olovnatého Závěr: Do protokolu uveďte pozorování. —CH-( H-COOH (SOjHJNH, cysteová kyselina CHrCHrCH-COOH I H-C OOH k NH-, metfaioninsulfon 46 E. DŮKAZ TRYPTOFANU Princip Tryptofan reaguje s kyselinou glyoxylovou (indolové jádro s oxoskupinou aldehydové části) v silně kyselém prostředí koncentrované H2SO4. Na rozhraní vzniká fialový prstenec. Pomůcky: Zkumavky, stojan na zkumavky, Chemikálie: Koncentrovaná (nebo ledová) CH3COOH, koncentrovaná H2SO4 Vzorek: Vaječný bílek Pracovní postup: 1. Roztok bílku - bílek smíchejte s 0,5% NaCl v poměru 1:1 nebo vodou ve stejném poměru 2. Do zkumavky nalijte 2 ml roztoku vaječného bílku 3. Přidejte 2 ml kone. CH3COOH a promíchejte 4. Směs opatrně podvrstvěte 2 ml kone. H2SO4. 5. Po několika minutách (až 15) se objeví fialový prstenec Závěr: Do protokolu uveďte pozorování. 47 F. DŮKAZ KASEINU A LAKTOSY V MLÉCE Princip Mléko obsahuje 5 % laktosy (mléčný cukr), 4 % bílkovin, 5 % tuku a 88 % vody. Z bílkovin má nej větší zastoupení (80 %) kasein, který patří mezi fosfoproteiny. Kasein je termostabilní -zvýšením teploty se nesrazí. Dále jsou z bílkovin v mléce obsaženy syrovátkové bílkoviny (laktalbumin, laktoglobulin, sérový albumin). Syrovátkové proteiny se nachází v mléčném séru po vysrážení kaseinu. Tyto syrovátkové proteiny podléhají denaturaci nad 60 °C. Při zahřívání mléka k varu dochází k denaturaci syrovátkových proteinů (tedy laktalbuminu, laktoglobulinu, sérového albuminu) - tuto denaturaci lze pozorovat jako vznik škraloupu na hladině. Přidáním octa nebo zředěné kyseliny chlorovodíkové k vychladlému mléku dochází k vysrážení kaseinu (fosfoprotein). Kasein se v mléce shlukuje do micel, na jejichž povrchu jsou vázány ionty a hydrofilní sérové bílkoviny, které chrání vnitřní hydrofobní obsah. Snižováním pH dochází k porušování povrchových struktur kaseinových micel, tím dochází k uvolnění kaseinu a jeho denaturaci. Takto uvolněný kasein již není rozpustný, a proto tvoří sraženinu. Tento typ srážení je vratný - neutralizací mléka dojde k opětovnému rozpuštění kaseinu. Tohoto kyselého srážení kaseinu se využívá při výrobě jogurtů nebo tvarohů. V potravinářství slouží ke kyselému srážení kaseinu bakterie mléčného kvašení, které produkují kyselinu mléčnou. Filtrací dochází k oddělení vysráženého kaseinu. Ve filtrátu lze následně dokázat přítomnost laktosy - mléčného cukru. Laktosa patří mezi disacharidy a obsahuje galaktosu a glukosu. Systematický název zní P-D-galaktopyranosyl-(1^4)-P-D-glukopyranosa. Laktosa obsahuje glykosidickou vazbu mezi 1. uhlíkem galaktosy a 4. uhlíkem glukosy. Na glukose je tedy volná hydroxylová skupina na 1. uhlíku - tzv. poloacetalový hydroxyl. Může tedy docházet k oxidaci na tomto uhlíku, a tudíž laktosa patří mezi redukující sacharidy. Laktosa se tedy oxiduje (přesněji 1. uhlík glukosy), Cu2+ (obsažené ve Fehlingově činidle) se redukují na oranžovou sraženinu oxidu měďného. Po přikápnutí Fehlingova činidla ke sraženině kaseinu lze pozorovat tvorbu fialového zbarvení. Dochází k reakci mezi Cu2+ a peptidovou vazbou -CO-NH- za vzniku komplexu Cu2+ a dané bílkoviny. Vzniklý komplex je barevný - fialový. V mléce lze tedy dokázat 3 složky - syrovátkové bílkoviny, které denaturují při teplotě nad 60 °C (škraloup). Dále lze dokázat kasein kyselým srážením (pomocí octa nebo zředěné HC1) a následně pomocí Fehlingova činidla. Provedením Biuretové reakce lze dokázat přítomnost peptidové vazby (fialové zbarvení). Laktosu přítomnou ve filtrátu lze dokázat pomocí Fehlingova činidla - laktosa je redukující disacharid, a proto redukuje Cu2+ na oranžovou sraženinu oxidu měďného. Pomůcky: Petriho misky, vodní lázeň Chemikálie: ocet nebo zř. HC1, Fehlingovo činidlo (Fehlingovo činidlo I - roztok CuS04-5H20; Fehlingovo činidlo II - vinan sodno-draselný (Seignettova sůl), NaOH), Vzorek: Mléko Pracovní postup: 1. Do kádinky nalijte 50 ml mléka a opatrně zahřejte k varu. Obsah kádinky nechte vychladnout. 2. Po vychladnutí odeberte z povrchu škraloup a k převařenému mléku přidejte cca 15 ml octa či 5 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové. Vzniká sraženina. 48 3. Obsah kádinky zamíchejte tyčinkou a zfiltrujte j ej - přes plátýnko/kapesník j ako galalit 4. Přefiltrováním této sraženiny získáváme bezbarvý filtrát, na filtračním papíře se zachytí bílá sraženina. 5. Část sraženiny zachycené na filtračním papíře přeneste na Petriho misku a přikapejte pár kapek Fehlingova činidla I a II. Po nakapání Fehlingova činidla na část sraženiny zachycené na filtru se objeví fialové zbarvení. 6. Odeberte 5 ml filtrátu do zkumavky a přidejte k němu 5 ml Fehlingova činidla I a II. 7. Zkumavku ponořte do vodní lázně nebo ji zahřejte nad kahanem. 8. Při zahřívání zkumavky lze pozorovat vznik oranžové sraženiny. Závěr: Do protokolu uveďte pozorování. spojit rovnou s výrobou galalitu 49 Úloha č. 6: KYSELÁ HYDROLÝZA BÍLKOVIN (denaturace kolagenu na klíh) Kolagen je složitá bílkovina, tvořící cca. 25 - 30 % hmotnosti kostí a cca. 36 % hmotnosti kůží. Kosti a kůže jsou tedy hlavní suroviny pro výrobu klihů a želatin, což jsou v obou případech denaturovaný kolagen. Zelatina má více zachovánu molekulovou hmotnost a vyšší čistotu, kdežto klíh má více odbouranou molekulovou hmotnost (tzn. nižší Mw) a nižší čistotu. V obou případech je prvním krokem výroby vyluhování mírně denaturovaného kolagenu z kostí či kůží v mírně alkalickém prostředí (pH cca. 10) na tzv. glutinový roztok. Protože je tento technologický krok časově náročný, vyjdeme z průmyslově vyrobeného kolagenu. Pomůcky: varná baňka 250 ml, zpětný chladič, míchadlo, pipeta, odměrný válec 100 ml, olejová lázeň s regulací teploty lázně, Petriho misky, univerzální indikátorový papírek Vzorky: průmyslově vyrobený kolagen Chemikálie: Koncentrovaná H2S04, 2 M NaOH, 2 M H2S04 Pracovní postup: 1. Ve varné baňce připravte suspenzi 5 g průmyslového kolagenu ve 150 ml vody. 2. K suspenzi přidejte 5 kapek koncentrované H2SO4. 3. Za stálého míchání zahřívejte 30 min. 4. Obsah v baňce nechte vychladnout na laboratorní teplotu a zneutralizujte 2 M NaOH, kontrolujte indikátorovým pH papírkem. 5. Do Petriho misky odeberte 10 ml vychladlého vzorku. 6. Vznikne tzv. klihová galerta, podobná rosolu. 7. Pokud rosol nevznikne, vložte roztok do rotační vakuové odparky a zakoncentrujte. 8. Po zmenšení objemu o cca. třetinu zkuste znovu vytvořit tzv. klihovou galertu. 9. Postup opakujte s tím rozdílem, že místo H2SO4 přidejte 10 ml 2 M NaOH a po reakci neutralizujte 2 M H2SO4. Závěr: Pomocí skleněné tyčinky ověřte viskozitu produktu. 50 Úloha č. 7: VÝROBA GALALITU Z KASEINU Galalit vzniká reakcí kaseinu a formaldehydu. Výsledný „plast" je tvrdý a nelze jej tvarovat. Je nerozpustný ve vodě, biodegradovatelný, relativně nehořlavý. Lze je probarvovat. Napodobovala se jím slonovina, rohovina, želvovina i dřevo. Uplatnil se módním průmyslu (knoflíky), k výrobě šperků, hřebenů rukojetí deštníků, per, kláves piín. Patentován r. 1900. Pomůcky: Petriho miska, sítko, plátěný kapesník, rukavice Chemikálie: Mléko (trvanlivé plnotučné), ocet, koncentrovaný formaldehyd Pracovní postup: 1. Odměřte v kádince 150 ml mléka a 100 ml octa, obě kapaliny slijte a důkladně promíchejte, až dojde k důkladnému sražení. 2. Vzniklou sraženiny v rukavicích přefiltrujte přes plátěný kapesník, vytlačte všechnu možnou kapalinu. 3. Hmotu rozdělte na tři díly. 4. Jednu třetinu vláčné hmoty přidejte do formaldehydu a 5 minut povařte. Pomocí rukavic přefiltrujte přes sítko s plátěným kapesníkem. Z hmoty na plátně vytvarujte knoflík a nechte vyschnout do dalšího cvičení. 5. Z druhé a třetí třetiny vytvarujte rovnou knoflík. 6. Druhou třetinu položte do formaldehydu a nechte vytvrzovat v uzavřené Petriho misce do dalšího cvičení. 7. Třetí knoflík nechte vyschnout pouze za laboratorní teploty. Vyhodnocení a závěr: Vzájemně porovnejte vzhled a tvrdost materiálu. H2C=0 51 Úloha č. 8: STANOVENÍ AMINOKYSELIN / BÍLKOVIN A. STANOVENÍ AKTIVNÍ KYSELOSTI MLÉČNÝCH VÝROBKŮ Princip: Aktivní kyselost se stanoví pomocí pH metru a vyjadřuje tak koncentraci vodíkových iontů. Obsah malého množství kyseliny nebo zásady se neprojevím změnou pH což je dáno obsahem bílkovin, fosfátů a citrátů přítomných v mléce. Pro tuto svou tlumivou (pufrující) schopnost není úplně nej lepším měřítkem hodnocení mléka. Nezachytíme totiž první stádium rozkladu laktózy jako změnu pH, i když se již vytvořilo určité množství kyseliny mléčné. U mléka je tak vhodnějším měřítkem kvality, resp. čerstvosti stanovení jeho titrační kyselosti. Bílkoviny, citráty i fosfáty jsou amfoterní látky - Pomůcky: pH-metr s elektrodou Vzorek: Mléko, smetana ke šlehání, acidofilní mléko, měkký tvaroh, sýr Lučina aj. Pracovní postup: Stanovení proveďte 3x. 1. 25 ml kapalného vzorku nalijte do kádinky. Z pevného vzorku odvažte 10 g, přidejte 30 ml destilované vody a zhomogenizujte třepáním. 2. Elektrodu pH-metru ponořte do analyzovaného vzorku. 3. Po ustálení odečtěte hodnotu pH na stupnici přístroje. 4. Hodnoty zprůměrujte a porovnejte s tabulkou Vyhodnocení a závěr: Jako výsledek uveďte aritmetický průměr hodnot aktivní kyselosti vzork. Na základě srovnání změřených hodnot s hodnotami z tabulky určete charakteristiku mléčného výrobku. Tab. Hodnoty pH vybraných mléčných výrobků. Hodnota pH Charakteristika výrobku 6,5-6,8 Mléko sladké, čerstvé 6,3-6,4 Mléko nakyslé 5,4-6,2 Mléko kyselé 6,8-7,1 Mléko pravděpodobně ředěné vodou či s přídavkem alkálií, nebo mléko od nemocných dojnic, či mléko staré s proteolytickým rozkladem 4,6 Vysrážení kaseinu z mléka (isoelektrický bod) 5,1 Smetana k výrobě zakysaného másla 6,3 Smetana k výrobě částečně zakysaného másla 5,2 Mezní hodnota při zakysání jogurtů B. TITRAČNÍ STANOVENÍ KYSELOSTI MLÉČNÝCH VÝROBKŮ (Soxhlet-Henkelova metoda Princip: 52 Kyselost dle Soxhlet-Henkela udává množství odměrného roztoku NaOH (0,25 mol 1_1) v ml potřebné k neutralizaci 100 ml mléka (100 g vzorku) na indikátor fenolftalein. Hodnota se udává ve stupních Soxhlet-Henkela (°SH), dle SI by měla být v jednotkách mmol-dm"3. Celková kyselost čerstvého mléka by dle ČSN 57 0529 měla být v rozmezí 6,2 - 7,8 SH. Kyselost mléka může narůst s časem nad hodnotu nativní kyselosti. Tento jev je způsoben rozkladem laktózy na kyselinu mléčnou činností mikroorganismů. Pomůcky: Dělená pipeta 1 ml, Chemikálie: Mléko, 1% ethanolický roztok fenolftaleinu, 0,25 mol l"1 NaOH Pracovní postup: 1. Do titrační baňky 250 ml pomocí odměrného válce nalijte 50 ml mléka a přikápněte 2 ml roztoku fenolftaleinu 2. Směs titrujte odměrným roztokem NaOH do slabě růžového zbarvení, které musí vydržet alespoň 30 vteřin 3. Titraci proveďte 3 x Vyhodnocení a závěr: Vypočítejte kyselost mléčného produktu dle SH = VNa0H ■ F SH = kyselost dle Soxhlet-Henkela V = objem odměrného roztoku NaOH v ml potřebného k neutralizaci F = přepočítávací faktor pro: mléko a smetana = 2, tvaroh 53 C. STANOVENÍ BÍLKOVIN V MLÉCE (Pyneho metoda) Pomůcky: titrační baňka (3x), dělená pipeta 1 ml, odměrný válec 5, 10 a 50 ml, pH-papírky, filtrační papír, byreta Chemikálie: 1% ethanolický roztok fenolftaleinu, nasycený roztok C2K2O4 . H2O, 0,143M NaOH, zneutralizovaný formaldehyd, 0,0025% roztok fuchsinu, mléko Pracovní postup: 4. Do titrační baňky pomocí odměrného válce nalijte 50 ml mléka, přikápněte 0,5 ml roztoku fenolftaleinu a 2 ml C2K2O4 . H2O. Obsah baňky promíchejte a nechte 2 minuty odstát. 5. Roztok v baňce zneutralizujte 0,143M NaOH (kontrolujte pH papírkem) a přidejte 10 ml zneutralizovaného formaldehydu. Obsah baňky promíchejte a nechte opět 2 minuty odstát. 6. Odbarvený roztok titrujte 0,143M NaOH do barvy srovnávacího roztoku. 7. Srovnávací roztok připravte do druhé titrační baňky. K 50 ml mléka přidejte 3 ml roztoku fuchsinu a promíchejte. 8. Stanovení proveďte třikrát. Vyhodnocení a závěr: Procentuální obsah bílkovin v mléce lze stanovit přepočítávacím koeficientem (0,348) na základě zjištěné titrační spotřeby NaOH: % bílkovin = (objem 0,143M NaOHpři neutralizaci v ml) . 0,348 Jako výsledek uveďte procentuální obsah bílkovin ve vzorku vypočítaný jako aritmetický průměr ze tří titrací. 54 D. STANOVENÍ BÍLKOVIN V MLÉCE (metoda dle Schulze) Pomůcky: titrační baňka (3x), dělená pipeta 1 ml, odměrný válec 5, 10 a 50 ml, magnetické míchadlo, pH-papírky, filtrační papír Chemikálie: 1% ethanolický roztok fenolftaleinu, nasycený roztok K2(COO)2-H20 (40 g na 100 ml), 0,143 moll-1 NaOH, zneutralizovaný formaldehyd, 5% roztok C0SO4, mléko Pracovní postup: Srovnávací roztok - ke 25 ml mléka přidejte 1 ml roztoku šťavelanu draselného a 0,5 ml roztoku C0SO4, promíchejte. Neutralizace formaldehydu - ke 20 ml formaldehydu přidejte 3 kapky fenolftaleinu a neutralizujte 0,143 moll-1 NaOH do slabě růžového zbavení Vlastní titrace - stanovení proveďte třikrát. 1. Do titrační baňky pomocí odměrného válce nalijte 25 ml mléka, přikápněte 3-5 kapek roztoku fenolftaleinu a 1 ml K2(COO)2H20. 2. Obsah baňky promíchejte a nechte 2 minuty odstát. Nenechávat o moc déle, dělat průběžně 3. Roztok v baňce zneutralizujte 0,143M NaOH do růžového zbarvení. Zaznamenejte hodnotu. {cca 1- l,5ml) 4. Ke zneutralizovanému vzorku přidejte 5 ml zneutralizovaného formaldehydu. Obsah baňky promíchejte a nechte opět 2 minuty odstát. 5. Odbarvený roztok titrujte 0,143 moll-1 NaOH do barvy srovnávacího roztoku. Vyhodnocení a Spotřeba NaOH při druhé titraci (po přidání formaldehydu) udává tzv. bílkovinný titr, tedy přímo procentuální zastoupení bílkovin ve vzorku mléka. Ze zjištěného obsahu bílkovin lze orientačně vypočítat obsah kaseinu ve vzorku: K = Bo/o ■ 0,778 Závěr: Jako výsledek uveďte objemová procenta zastoupení bílkovin v mléce. Srovnejte výsledek s výsledkem získaným ze stanovení bílkovin dle Pyneho. 55 E. STANOVENÍ POPELA V KASEINU Pomůcky: muflová pec s nastavitelnou teplotou, analytické váhy, exsikátor, žíhací kelímek (2x), lžička Chemikálie: kasein Pracovní postup: 1. Na analytických vahách zvažte přežíhaný a vychladlý kelímek. 2. Na analytických vahách navažte přibližně 1,5 g kaseinu. 3. Kelímek se vzorkem opatrně spalte nad plynovým kahanem a poté žíhejte v muflové peci 30 minut při 500 °C. 4. Nechte alespoň 5 min vychladnout na kovové síťce. 5. Kelímek přemístěte do exsikátoru, kde jej ponechejte zchladnout na pokojovou teplotu. Kelímek následně zvažte. 6. Žíhání a vážení opakujte do konstantní hmotnosti popela (rozmezí 0,2 mg). Vyhodnocení a závěr: Stanovte obsah popela v kaseinu v hmotnostních % dle vztahu: m1 mpopel = — ■ 100 m0 Kde m = navážka vzorku kaseinu v g mi = hmotnost popela v g mtuk = obsah popela v % Uveďte obsah popela a srovnejte s hodnotou obsahu popela kaseinu uváděnou v literatuře. Kvalitní kasein by měl obsahovat 2 % popela 56 F. STANOVENÍ OBSAHU TUKU V KASEINU Pomůcky: Erlenmayerova baňka 50 ml, dělička 150 ml (2x), varná baňka 250 ml, teploměr s rozsahem do 100 °C, vařič nebo elektromagnetická míchačka Chemikálie: 37% HC1, 96% ethanol, petrolether, kasein Pracovní postup: 1. Do Erlenmayerovy baňky navažte 3 g kaseinu a přidejte 15 ml HC1 a přikryjte zátkou. 2. Na vodní lázni směs zahřívejte na 40 °C do rozpuštění kaseinu. 3. Po úplném rozpuštění roztok zchlaďte a přilijte 10 ml horké vody. 4. Přelijte do dělicí baňky. 5. Erlenmayerovu baňku vypláchněte 40 ml ethanolu a obsah přelijte do dělicí baňky a znovu vypláchněte petroletherem (50 ml), který také přilijte do dělicí baňky. 6. Obsah dělicí baňky důkladně protřepejte (pozor na natlakování aparatury). Spodní vrstvu vypusťte do 250 ml kádinky. Horní vrstvu nalijte do předem zvážené 250 ml varné baňky s varnými kamínky. 7. Spodní vrstvu vraťte zpět do dělicí baňky a přilijte 20 ml petrol etheru a 10 ml ethanolu. Protřepejte a petroletherovou vrstvu přidejte do varné baňky. 8. Petrol ether odpařte na vakuové odparce. 9. Zbytek petroletheru dosušte v sušárně na chemikálie při 80 °C. 10. Po vychladnutí baňky v exsikátoru ji zvažte. Vyhodnocení a závěr: Stanovte obsah tuku v kaseinu v hmotnostních % dle vztahu: m1 mtUk = — -100 m Kde m = navážka vzorku kaseinu v g mi = hmotnost izolovaného tuku v g mtuk = obsah tuku v % Uveďte stanovené množství tuku v kaseinu (hmotnostně i procentuálně). 57 G. ORIENTAČNÍ STANOVENÍ VISKOSITY KASEINU Pomůcky: odměrný válec 5 a 50 ml, nálevka, kádinky, teploměr s rozsahem do 100 °C, skleněná tyčinka, stopky, byrety Chemikálie: kasein, 27% NH3 Pracovní postup: Pracujte v digestoři!! 1. Do 150 ml kádinek navažte 0,5; 1,0; 1,5; 2 ... až maximálně 4 g kaseinu(s přesností na 0,1 g), přidejte 20 ml vody a 2 ml NH3. 2. Směsi za neustálého míchání skleněnou tyčinkou zahřívejte ve vodní lázni na teplotu 60 °C do úplného rozpuštění kaseinu. 3. Připravte si byretu, do nichž nalijte ještě teplý kaseinový roztok. Pracujte rychle (všechny roztoky by měly být přibližně stejně teplé). 4. Pomocí stopek stanovte časy, než vyteče vždy 10 ml kaseinového roztoku. 5. Zbytky kaseinového roztoku vylijte z byret, ochlaďte na 30 °C a senzoricky vyhodnoťte za pomoci skleněné tyčinky (sledujte především viskozitu). Vyhodnocení a závěr: Jako výsledek uveďte graf závislosti koncentrace kaseinového roztoku rychlosti vytékání z byrety. Popište vzhled a chování jednotlivých zchladlých roztoků kaseinu. 58 Úloha č. 9: MEĎNATÉ HEDVÁBÍ Princip výroby meďnatého hedvábí byl navržen roku 1857 Eduardem Schweizerem, kdy se čistá celulóza (vata, filtrační papír atd.) rozpouští v roztoku hydroxidu tetraamminměďnatého [Cu(NH3)4](OH)2, který lze připravit podle rovnice: CuS04 + 2NaOH -> Cu(OH)2 + Na2S04 Cu(OH)2 + 4NH4OH -> [Cu(NH3)4(H20)2](OH)2 + 2H20 Vazba mědi na celulózu probíhá dle následujícího schématu: -o -o + [Cu(NH3)4]2+ \ — O-... — o- :::cu2+(NH3)n Rovnováha reakce závisí na pH prostředí. V kyselém prostředí se pak rovnováha posunuje ve prospěch nerozpustné celulózy. Přístroje a pomůcky: kádinky, pinzeta, Erlenmayerova baňka (200 - 250 ml, 500 ml), Biichnerova nálevka, filtrační baňka, injekční stříkačka a jehla (kapilára, plastová hadička), pH papírky, kapátko. Chemikálie: CuS04.5H20, NaOH, NH3, H2S04 případně CH3COOH Vzorek: Buničitá vata - obsahuje část tzv. viskózy, což je regenerovaná celulóza Vatové odličovací tampóny - 100% celulóza Papírový kapesník - 100% celulóza Pracovní pláště - 100% celulóza Pracovní postup: Příprava Schweizerova činidla: 1. Připravte 250 ml 5% vodného roztoku CuS04. Pro lepší rozpouštění kádinku s obsahem zahřívejte. 2. Připravte 50 ml 8% vodného roztoku NaOH. 3. Roztok NaOH přidejte k roztoku CuS04. Smísením vznikne modrá sraženina Cu(OH)2. 4. Sraženinu dekantujte destilovanou vodou alespoň 3x, čímž dojde k odstranění rozpustných solí. Sraženinu přefiltrujte na Biichnerově nálevce a následněji převeďte do Erlenmayerovy baňky. Nepoužívejte fritu! 5. Vytvořte nasycený roztok Schweizerova činidla [Cu(NH3)4](OH)2 rozpuštěním sraženiny Cu(OH)2 v 70 - 100 ml koncentrovaného NH3. Sraženinu rozpouštějte v Erlenmayerově baňce. V případě, že se všechen Cu(OH)2 nerozpustí, odfiltrujte zbývající sraženinu na fritě, která je pro tento úkol vyhrazena. 59 Příprava meďnatého hedvábí: 1. Do baňky se 100 ml přefiltrovaného roztoku Schweizerova činidla přidejte 1 g natrhané celulózy (vata, plášť, odličovací tampónky, papírový kapesník aj.). 2. Během 60 min roztok občas protřepejte a sledujte, jak se vzorek rozpouští. Nerozpuštěnou celulózu odfiltrujte na pro tento účel vyhrazené fritě, promyjte vodou a sušte 2 h při 150 °C v sušárně. Pak zvažte a vypočítejte množství rozpuštěné celulózy. V případě, že se celulóza rozpouští pomalu, nechte rozpouštět do příštího cvičení. 3. Připravte 100 ml srážecího roztoku. K destilované vodě přikapávejte H2SO4 až do získání kyselého roztoku o pH 2 - 3 (pH kontrolujte pomocí indikátorového papírku) 4. Směs Schweizerova činidla s rozpuštěnou celulózou natáhněte do injekční stříkačky s jehlou a hadičkou. Roztok pomalu vkapávejte do srážecího roztoku. 5. V kyselém roztoku vznikají vlákna meďnatého hedvábí. 6. Vysrážená vlákna odfiltrujte na fritě (Búchnerově nálevce), vysušte 2 h při 150 °C v sušárně a zvažte. Závěr: Uveďte vlastní pozorování průběhu reakce, popište výsledný produkt. Uveďte hmotnost vysrážených vláken a procentuální výtěžek vzhledem k původní navážce a vzhledem k rozpuštěné celulóze. Uveďte veškeré potřebné výpočty. 60 MODERNÍ TRENDY V POLYMERNÍ CHEMII Současné trendy v oblasti polymerní chemie (přírodních i syntetických polymerů) se soustřeďují nejen na recyklace polymerních materiálů, ale i na vytvoření nanostruktur či nahrazení původních materiálů. Úloha č. 10: ELEKTROSTATICKÉ NANOZVLÁKŇOVÁNÍ PŘÍRODNÍCH POLYMERŮ Metoda elektrostatického zvlákňovaní, tzv. electrospinning, využívá elektrické síly k tvorbě nanovlákenných struktur z polymerního roztoku. Základem uspořádání jsou dvě protilehlé elektrody připojené k opačnému elektrickému potenciálu. První elektroda (zvlákňující elektroda, tzv. emitor) slouží k dávkování roztoku polymeru a tvorbě nanovláken. Elektroda může mít tvar od jednoduché jehlové elektrody (pro menší množství vzorku) po velké válcové či strunové elektrody rotující v nádobě s polymerním roztokem. Druhá elektroda, tzv. kolektor, slouží k ukládání vláken. Vlivem vysokého elektrického napětí (až desítky kV) se vytvoří na kapce roztoku polymeru kónický tvar, tzv. Taylorův kužel. Dalším zvýšením elektrického pole dojde k porušení povrchových sil natolik, že z vrcholu Taylorova kužele dojde k tvorbě vláken ve směru od zvlákňující elektrody ke kolektoru. Vytvořené vlákno z roztoku polymeru prochází v mezielektrodovém prostoru procesem nestability a prodlužování, při kterých dochází také k vypaření rozpouštědla. Vlákno polymeru je elektrostatickými silami přitahováno ke kolektoru a vytváří na něm souvislou vrstvu složenou z vláken o rozměrech desítek až stovek nanometrů. Vlivem chaotického pohybu vláken směrem ke kolektoru má výsledná vrstva strukturu náhodně uspořádaných vláken. Na schopnost vytvářet nanovlákenné vrstvy mají zásadní vliv parametry zvlákňovaného roztoku, geometrie použitých elektrod a okolní podmínky během procesu vláknění. Mezi roztokové parametry můžeme zařadit viskozitu, koncentraci, molekulovou hmotnost daného polymeru, vlastnosti rozpouštědla, povrchové napětí či vodivost. O zvláknitelnosti roztoku rozhoduje koncentrace vlákenného polymeru, což ovlivňuje jak viskozitu, tak povrchové napětí roztoku. Jestliže je roztok příliš zředěný, pak se budou vlákna polymeru rozpadat na kapičky dříve, než dosáhnou kolektoru a dochází k tzv. elektrospreyingu. Jestliže je naopak roztok příliš koncentrovaný, tak se vlákna nebudou tvořit vůbec. Jednou z nej důležitějších oblastí využití metody electrospinningu jsou biomedicínské aplikace. Ideální materiál musí být biokompatibilní, aby ani polymer ani produkty vzniklé jeho degradací nevyvolali zánětlivou nebo toxickou reakci v těle, musí mít povrch umožňující adhezi buněk a podporovat jejich růst, mít vhodnou (dostatečnou) porositu a dostatečnou mechanickou odolnost. Měl by být také biodegradabilní, biostabilní, voděodolný a vyrobitelný do 3D struktur s vlastnostmi a designem měnitelným podle potřeb zamýšlené aplikace. Převést přírodní biopolymer do podoby nanovláken prostřednictvím elektrostatického zvlákňovaní je obvykle těžší než u syntetických polymerů. Roztoky přírodních polymerů mají často příliš vysokou viskozitu a vysoké povrchové napětí, což omezuje jejich zvláknitelnost. 61 Obrázek 4,10: Nanospider TM (cit. http://academic.sun.ac.za/polymer/electrospinning.html, https://tech.ihned.cz/cl-23053440-nanotechnologie-z-liberce-maji-budoucnost-i-za-oceanem) Přístroje a pomůcky: kádinky, pinzeta, Erlenmayerova baňka se zátkou (250 ml, 500 ml), elektrody Nanospideru, Nanospider, ubrousky, tyčinka, váhy, odměrný válec, pipeta, nůžky Chemikálie a roztoky: organická rozpouštědla (kyselina trifluoroctová, tetrahydrofuran,) Použitý vzorek: Polymléčná kyselina - granulát (PLA) Pracovní postup: 1. Do Erlenmayerovy baňky s elektromagnetickým míchadlem navažte granulát PLA a zalijte rozpouštědlem tak, aby výsledný roztok byl 10%, 25% a 35%. 2. Baňku umístěte na elektromagnetickou míchačku, uzavřete zátkou a nechte granulát PLA rozpouštět do dalšího cvičení. 3. Samotné zvlákňovaní roztoku proveďte na UFE PřF MU pomocí Nanospideru TM. 4. Zvlákňujte nejprve z jehlové elektrody, kde vzorek roztoku polymeru nanášejte na vrchol elektrody pomocí skleněné tyčinky. 5. Vyb erte nej vhodnej ší koncentraci roztoku. 6. Tento roztok poté zvlákňujte pomocí válcové elektrody. 7. Vystřihněte navlákněný vzorek netkané textilie společně s nosnou textilií, nechte na vzduchu proschnout. 8. Pomocí SEM popište nanovlákenou strukturu, určete šířku vláken (její průměrnou hodnotu v závislosti na koncentraci zvlákňovaného roztoku). 9. Určete kontaktní úhel smáčení vodní kapkou, tedy hydrofobicitu/hydrofilitu materiálu. Závěr: Do protokolu uveďte SEM snímky, popis struktury vláken, hodnotu kontaktního úhlu. 62 Úloha č. 11: 3D TISK PŘÍRODNÍCH POLYMERŮ 3D tisk je proces tvorby trojrozměrných objektů pokládáním souvislých vrstev polymerního materiálu. K vytištění výrobku je potřeba několik kroků. Prvním krokem je vytvoření 3D modelu (např. pomocí CAD softwaru nebo 3D skeneru či fotogrammetrického softwaru). Tento model je nutné v druhém kroku převést do tiskárnou požadovaného formátu. Dalším krokem je volba vhodného polymeru a parametrů tisku (teplota tiskové hlavy, typ a teplota podložky). Následně je na tiskovou podložku nanášen tiskový materiál po vrstvách. Vždy po dokončení tisku vrstvy se posune tisková hlava (nebo podložka) o jednu vrstvu a zahájí se tisk další vrstvy. Většinou se po výtisku ještě objekt upraví opilovaním, odlomením tzv. podpůrných konstrukcí (u technologie FDM) nebo vyčištěním (jiné technologie). 63